农杆菌Ti质粒载体PCHF1302的构建方法及应用技术

农杆菌Ti质粒载体PCHF1302的构建方法及应用属于植物基因技术领域，本发明专利技术对农杆菌Ti质粒Pcambia1302上的酶切位点ECORI和HindIII处同时进行双酶切，将PCHF3300包含有35S启动子、NOS终止子以及MCS的完整的基因表达框通过PCR加上同源臂，将35S启动子启动的表达框成功的连接到质粒Pcambia1302上，构建成PCHF1302；经PCR等方法克隆得到的目的基因能便于连接到多个克隆酶切位点(MCS)，使目的基因能在植物体内稳定表达；在TDNA区域含有潮霉素抗性基因和mGFP5绿色荧光蛋白报告基因，能显著提高转基因植物的筛选效果。

【技术实现步骤摘要】
农杆菌Ti质粒载体PCHF1302的构建方法及应用
本专利技术属于植物基因
，具体涉及一种农杆菌Ti质粒载体PCHF1302的构建方法及应用。
技术介绍
近年来植物基因工程技术发展迅速，特别是转基因技术在基因功能研究中起着关键的作用，通过转基因技术，我们可以将要研究的基因转入到基因的来源植物或其他模式植物中去研究该基因的功能。在转基因之前需要完成基因表达载体的构建。但是目前常用的植物表达载体都存在着各种缺陷。如Pcambia1301、Pcambia1302缺乏目的基因表达的35S启动子和终止子，无法直接用于构建基因表达载体。
技术实现思路
专利技术的目的在于提供一种农杆菌Ti质粒载体PCHF1302的构建方法。经PCR等方法克隆得到的目的基因，可以多种方式连接到该质粒载体的35S启动子与E9终止于之间的多个克隆酶切位点(MCS)，使目的基因能够在植物体内稳定表达；该质粒载体在TDNA区域以外含有卡那抗性基因，便于在原核细胞中筛选单克隆阳性菌落，在TDNA区域含有潮霉素抗性基因和mGFP5绿色荧光蛋白报告基因，能够显著提高转基因植物的筛选效果。本专利技术的农杆菌Ti质粒载体PCHF1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种农杆菌Ti质粒载体PCHF1302构建方法，其特征在于包括下列步骤:S1.包含有35S启动子、E9终止子和多克隆位点MCS的表达框的获得S11.将农杆菌Ti质粒Pcambia1302与PCHF3300的MCS区域比较，使重组质粒PCHF1302MCS区域有最多酶切位点；最终在农杆菌Ti质粒Pcambia1302的MCS区域选择EcoRI和HindIII这两个酶切位点；S12.在EcoRI酶切位点选择18bp序列作为上游引物的同源臂记为B‑F，在HindIII酶切位点的下游18bp序列作为下游引物的同源臂记为B‑R，在PCHF3300表达框35S上游选择bp作为上游引物35S‑F，在PC...

【技术特征摘要】
1.一种农杆菌Ti质粒载体PCHF1302构建方法，其特征在于包括下列步骤:S1.包含有35S启动子、E9终止子和多克隆位点MCS的表达框的获得S11.将农杆菌Ti质粒Pcambia1302与PCHF3300的MCS区域比较，使重组质粒PCHF1302MCS区域有最多酶切位点；最终在农杆菌Ti质粒Pcambia1302的MCS区域选择EcoRI和HindIII这两个酶切位点；S12.在EcoRI酶切位点选择18bp序列作为上游引物的同源臂记为B-F，在HindIII酶切位点的下游18bp序列作为下游引物的同源臂记为B-R，在PCHF3300表达框35S上游选择bp作为上游引物35S-F，在PCHF3300表达框E9终止子下游选择bp作为下游引物E9-R；由上得出上游引物F(B-F+35S-F)：TGACCATGATTACGAATTAAAGGGCAATTG下游引物R(B-R+E9-R)：GACGGCCAGTGCCAAGCTAGCTTCGATTGAS13.以PCHF3300质粒为模板，用KOD-FX高保真酶将包含有35S启动子、E9终止子以及MCS的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王庆钰，王康，李景文，张宇晨，王英，闫帆，刘雅婧，杨旭光，张鑫生，赵磊，隋媛媛，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22