小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体及其构建方法技术

本发明专利技术公开了小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体，该侵染性克隆表达载体是由小西葫芦黄花叶病毒全基因组通过同源重组的方式克隆到含有花椰菜花叶病毒35S启动子的pCambia0390双元载体上制备得到；所述小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。本发明专利技术构建得到能通过农杆菌浸润方法接种并稳定高效侵染甜瓜、西葫芦等寄主植物的小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆，该侵染性克隆同时还能高效表达外源蛋白。

Infectious Cloning and Expression Vector of Pumpkin Yellow Mosaic Virus and Its Construction Method

The invention discloses an infective clonal expression vector of small squash yellow mosaic virus, which is prepared by cloning the whole genome of small squash yellow mosaic virus by homologous recombination onto pCambia0390 binary vector containing 35S promoter of cauliflower mosaic virus; the nucleotide sequence of the infective clonal expression vector of small squash yellow mosaic virus As shown in SEQ ID NO.9. The invention constructs a small squash Yellow Mosaic Virus Infective clone which can inoculate and stably infect host plants such as melon and squash by Agrobacterium tumefaciens infiltration method. The infective clone can also efficiently express exogenous proteins.

【技术实现步骤摘要】
小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体及其构建方法
本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及一种小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体及其构建方法。
技术介绍
马铃薯Y病毒属(Potyvirus)是植物RNA病毒中最大的属，能够侵染约有27属170多种植物。小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus，ZYMV)是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)主要成员之一，能够侵染甜瓜、黄瓜、西葫芦、中国南瓜、笋瓜、丝瓜、西瓜等多种葫芦科作物，对农作物生产造成重大的经济损失。Potyvirus作为RNA病毒，不易分离纯化，也难以开展相关反向遗传学研究。而构建Potyvirus病毒的全长基因组cDNA侵染性克隆则克服了其难以进行遗传操作的难题，同时Potyvirus病毒采用多聚蛋白策略，可以利用该特点构建超表达载体。因此获得马铃薯Y病毒属的侵染性克隆表达载体具有广泛应用前景。侵染性克隆是指将病毒全长基因组序列构建在特定载体上，且具有侵染宿主的功能。根据病毒基因组(DNA或RNA)类型不同，通常分为全长DNA侵染性克隆或全长cDNA侵染性克隆。但全长性的侵染性cDNA克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体，其特征在于，该侵染性克隆表达载体是由小西葫芦黄花叶病毒全基因组通过同源重组的方式克隆到含有花椰菜花叶病毒35S启动子的pCambia0390双元载体上制备得到；所述小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

【技术特征摘要】
1.一种小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体，其特征在于，该侵染性克隆表达载体是由小西葫芦黄花叶病毒全基因组通过同源重组的方式克隆到含有花椰菜花叶病毒35S启动子的pCambia0390双元载体上制备得到；所述小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。2.权利要求1所述的小西葫芦黄花叶病毒侵染性克隆表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从感染小西葫芦黄花叶病毒的发病株中提纯病毒粒子，并提取病毒粒子中的RNA；(2)以步骤(1)的RNA为模板进行反转录，以反转录产物为模板，以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列作为特异性引物进行PCR扩增，获得小西葫芦黄花叶病毒全基因组；(3)通过同源重组的方法将小西葫芦黄花叶病毒全基因组连接到改造后的pCambia0390双元载体pCa35S上，即得到小西葫芦黄花叶病毒全基因组侵染性克隆表达载体。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，反转录的反应程序为：将模板RNA、Oligo(dT)18、SEQIDNO.2所示的引物、dNTP和RNasefreedH2O混合，65℃保温5min，迅速置于冰上冷却2min，瞬间离心；再加入5×SSIVBuffer(ThermoFisher)、DDT、RRI(RNaseInhibitor)和SuperScriptIVReverseTranscriptase(ThermoFisher)；55℃，45min；80℃，10min，终止反应；再加入RNaseH...

【专利技术属性】
技术研发人员：田延平，王健，李向东，耿超，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37