氯苯类有机污染场地可通过厌氧微生物降解作用发生自然衰减的评估方法技术

本发明专利技术公开了一种氯苯类有机污染场地可通过厌氧微生物降解作用发生自然衰减的评估方法，该方法通过对污染场地中地下水样品进行实时定量PCR(qPCR)检测，获取目前已知的所有氯苯类物质还原脱卤菌(包括Dehalobacter，Dehalogenimonas和Dehalococcoides)的绝对数量，快速经济地确定场地中的氯苯类污染物是否可通过厌氧微生物降解作用发生自然衰减。

【技术实现步骤摘要】
氯苯类有机污染场地可通过厌氧微生物降解作用发生自然衰减的评估方法
本专利技术涉及地下水污染修复领域，特别是一种氯苯类有机污染场地可通过厌氧微生物降解作用发生自然衰减的评估方法。
技术介绍
地下水是我国重要的战略资源，它在维护城市经济社会健康发展等方面发挥着不可替代的作用。我国北方地区65％的生活用水、50％的工业用水和33％的农业灌溉用水来自地下水，全国655个城市中，约400多个城市以地下水为饮用水源(环保部，全国地下水污染防治规划，2011)。近年来随着经济社会的高速发展，地下水环境压力逐渐增大，我国主要城市地下水、尤其是浅层地下水受到不同程度的污染(高存荣,王俊桃2011.我国69个城市地下水有机污染特征研究.地球学报[J],32:581-591)，并且已由局部扩展到区域、隐性变为显性、无机污染发展到有机污染。地下水污染具有持久性、隐蔽性、复杂性和难以治理等特点，对生态和人类健康产生了极大的威胁(QIUJ2010.Chinafacesuptogroundwatercrisis.Nature[J],466:308)，受到国内外科研人员和政府机构的高度关注。但我国地下水污染修复尚处于起步阶段，迫切需要开发各种经济、有效、绿色环保的修复技术。氯苯类物质是指苯环上氢原子被氯原子取代后形成的化学物质，根据取代氯的数量和在苯环上位置的不同，一共有12种氯苯类物质。该类有机物作为一种化工原料和中间体，在染料、医药、农药、橡胶、电器产品生产行业中被广泛应用(王芳,DRFLERU,SCHMIDM,etal.2007.1,2,4-三氯苯矿化菌的鉴定与功能分析.环境科学[J],28:1082-108)。由于其大量使用和不合理处理，氯苯类污染物在土壤、地下水、沉积物、蔬菜等环境介质中均检出(宋洋,王芳,蒋新2011.微生物降解1,2,4-三氯苯研究进展.土壤[J],43:343-349)。此外，有机氯农药六六六也可以经过生物或非生物过程的还原脱氯反应产生氯苯类物质(DOESBURGW,EEKERTMH,MIDDELDORPPJ,etal.2005.Reductivedechlorinationofβ-hexachlorocyclohexane(β-HCH)byaDehalobacterspeciesincoculturewithaSedimentibactersp.FEMSMicrobiol.Ecol.[J],54:87-95；LIUX,PENGPA,FUJ,etal.2003.EffectsofFeSontheTransformationKineticsofγ-Hexachlorocyclohexane.EnvironSciTechnol[J],37:1822-1828)。该类污染物也是我国工业场地的土壤与地下水中常见的污染物(陈然然,祝欣,林玉锁等2015.氯代有机物污染场地的监控自然衰减修复初探.化工学报[J],66:2361-2369)。氯苯类物质化学性质稳定，能在环境中长期滞留，并易于生物富集，可致人肝肾损害，具有潜在致癌性，对生态环境和人体健康构成威胁。因此，开展氯苯类污染场地修复具有重要实际意义。而现行的修复技术中，自然衰减法具有运行成本低、效益高、对场地扰动小，并且可以作为一些低浓度污染场地的一项长期的修复技术而使用等优点，越来越受到重视。而微生物降解作用是最重要的、破坏性的自然衰减作用。一般认为微生物降解作用是自然衰减法成功与否的关键。但好氧微生物修复通常受到以下几个方面因素的限制：1)地下水含氧量较低；2)地下水中溶解的少量氧气容易被好氧降解菌降解结构简单的分子而快速消耗掉；3)将足够量的氧气泵入地下水，工程复杂且成本较高；4)氯苯类物质属于重非水相有机物，易在重力作用下向下迁移到深层厌氧承压含水层。因此，厌氧微生物降解作用在氯苯类污染场地的自然衰减中至关重要。那么，在实施通过厌氧微生物降解作用下的自然衰减法，首先需对污染场地进行厌氧微生物降解可行性的评估。原位厌氧微生物修复之前，需对污染场地进行微生物修复可行性评估。目前针对场地自然衰减评估多参考美国环保署在1998年公布的方法(TechnicalProtocolforEvaluatingNaturalAttenuationofChlorinatedSolventsinGroundWater)。该方法建议从以下三个方面的证据来确认场地自然衰减的发生：1)有表征自然衰减过程的环境地球化学指标；2)历史监测数据表明污染物含量有降低趋势，且地下水污染羽浓度的降低不仅仅是污染羽迁移造成的；3)微宇宙实验直接证明自然衰减过程的发生。目前，利用还原脱卤菌评估氯苯类有机污染场地可通过厌氧微生物降解用发生自然衰减的评估方法尚未见报道。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种氯苯类污染场地的通过厌氧微生物降解作用发生自然衰减的技术评估方法。为实验上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种氯苯类有机污染场地可通过厌氧微生物降解发生自然衰减的评估方法，包括以下步骤：(1)首先对场地进行调查，明确污染物范围，再对污染场地中不同污染区域进行地下水样品的采集，采集区域包括污染源源、和污染羽区域(即污染物随着地下水运移的区域)和背景无污染区域，取样范围如图1所示；其中，污染源区和污染羽区域可能存在高浓度的污染物降解菌，每个污染区域的样品均需有3个平行样，每份地下水样品至少含有1L地下水。(2)将地下水样品以10000g的速度离心15分钟，丢弃上清液，收集离心管底部沉积物进行DNA提取；或者直接在场地中使用无菌过滤膜过滤地下水样品，丢弃过滤后的地下水，收集滤膜进行DNA提取。上述DNA提取步骤为本领域常规技术，可采用MOBIOLaboratories公司的DNAIsolationKit试剂盒，或其他本领域通用的DNA提取方法。(3)准备好含有Dehalobacter，Dehalogenimonas和Dehalococcoides16SrRNA基因的质粒，作为表样进行qPCR实验，(4)准备如表1所示引物，菌株Dehalococcoides上游引物1f(其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)；下游引物264r(其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)；菌株Dehalobacter上游引物477f(其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示)，下游引物647r(其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示)；菌株Dehalogenimonas上游引物273f(其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示)，下游引物537r(其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示)。表1氯苯类物质微生物修复实验qPCR实验引物Dehalobacter菌株、Dehalogenimonas菌株和Dehalococcoides菌株均为本领域已公开菌株，其中表1中所涉及的引物可参见以下文献公开内容：1)Dehalococcoides引物参考文献为Hendrickson,E.R.；Payne,J.A.；Young,R.M.；Starr,M.G.；Perry,M.P.；Fahnestock,S.；Ellis,D.E.；Ebersole,R.C.,MolecularanalysisofDehalococcoides16Sribos本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氯苯类有机污染场地可通过厌氧微生物降解作用发生自然衰减的评估方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）采集污染场地中污染区域地下水样品并提取样品DNA；所述污染区域包括污染源区域、背景无污染区域和污染羽区域；(2)对步骤（1）提取的样品DNA进行qPCR反应，分别扩增

【技术特征摘要】
1.一种氯苯类有机污染场地可通过厌氧微生物降解作用发生自然衰减的评估方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）采集污染场地中污染区域地下水样品并提取样品DNA；所述污染区域包括污染源区域、背景无污染区域和污染羽区域；(2)对步骤（1）提取的样品DNA进行qPCR反应，分别扩增Dehalobacter菌株、Dehalogenimonas菌株和Dehalococcoides菌株；同时以已知浓度的Dehalobacter菌株、Dehalogenimonas菌株和Dehalococcoides菌株的16SrRNA基因质粒作为qPCR实验的标样；获得总细菌、Dehalobacter菌株、Dehalogenimonas菌株和Dehalococcoides菌株的数量；其中，Dehalobacter菌株的正链引物和反链引物分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；Dehalogenimonas菌株的正链引物和反链引物分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；Dehalococcoides菌株的正链引物和反链引物分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；(3)对总细菌、Dehalobacter菌株、Dehalog...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶淑君，吴吉春，乔文静，唐先进，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32