一种提高蛋白表达效率的方法及表达载体技术

本发明专利技术提供一种提高蛋白表达效率的方法及表达载体，包括：在高密度生长阶段，控制重组毕赤酵母生长阶段的温度为30℃，使用25％氨水和30％磷酸调节pH，使体系的pH控制在5.5，并按预设时间加入10ng/ml‑1μg/ml的褪黑激素；在高效表达阶段，当补料生长阶段结束后，将发酵温度降至22℃，同时流加含12mL/L PTM1的100％的甲醇；控制发酵液中甲醇浓度达到20g/L，诱导90h后结束发酵。不仅可以用于改造任意目的基因以提高其表达效率，还可以用于构建具有高表达效率特征的表达载体，使目的基因的蛋白表达效率提高2～5倍。

【技术实现步骤摘要】
一种提高蛋白表达效率的方法及表达载体
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种提高蛋白表达效率的方法及表达载体。
技术介绍
巴斯德毕赤酵母表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一。巴斯德毕赤酵母表达系统作为真核表达系统，有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点。可对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性，具有强有力的乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达，营养要求低，培养基廉价，生长快，与昆虫、哺乳动物等高等真核细胞相比，易于进行操作和培养。巴斯德毕赤酵母对需氧生长有强的偏好，这一生理学特性使它能高密度发酵生长，表达量高，有利于工业放大生产。巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于外源蛋白的分离和纯化。表达的外源蛋白可分泌到胞外，分泌的内源蛋白少，外源蛋白分离纯化简便；外源基因通过质粒整合到基因组上，基因工程菌株遗传稳定性好；胞内表达蛋白的分选和区域化，增加了表达蛋白的稳定性，减少表达产物对宿主菌的毒害作用；糖基化程度低，与酿酒酵母相比，巴斯德毕赤酵母不产生过度的糖基化；所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。高密度发酵是毕赤酵母提高蛋白表达量的一种重要策略，发酵工艺是高密度发酵的一个重要因素。但是高密度发酵过程中，各种条件难以控制，酵母细胞内部自由基积累严重，容易导致酵母死亡，进而影响了外源蛋白表达。
技术实现思路
本专利技术提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种提高蛋白表达效率的方法及表达载体，提供的提高基因蛋白表达效率的方法，不仅可以用于改造任意目的基因以提高其表达效率，还可以用于构建具有高表达效率特征的表达载体，使目的基因的蛋白表达效率提高2～5倍。根据本专利技术实施例的第一个方面，提供一种提高蛋白表达效率的方法，包括：在高密度生长阶段，控制重组毕赤酵母生长阶段的温度为30℃，使用25％氨水和30％磷酸调节pH，使体系的pH控制在5.5，并按预设时间加入10ng/ml-1μg/ml的褪黑激素；当发酵罐中甘油耗尽时，DO上升，以指数流加法流加含12mL/LPTM1的50％甘油，流速采用先上升后下降的方式，以通气量和搅拌转速控制DO在30％，直至菌体干重达到130g/L；在补料生长阶段，F为补料流速，Fccm为连续培养基本补料培养基CCM的流速，Fm为甲醇培养基的流速，w1为CCM补料比例，单位为％(W/V)；F＝Fccm*w1+FmD＝F/V＝μD为稀释率，V为发酵液体积，μ为比生长速率，w1的值是根据单位菌体对基本补料培养基的需求量，预先确定的流加比例；在高效表达阶段，当补料生长阶段结束后，将发酵温度降至22℃，同时流加含12mL/LPTM1的100％的甲醇；控制发酵液中甲醇浓度达到20g/L，诱导90h后结束发酵。根据本专利技术实施例的第二个方面，提供一种提高蛋白表达效率的载体，包括如本专利技术实施例的第一个方面所述的毕赤酵母。本专利技术提出一种提高蛋白表达效率的方法及表达载体，包括：在高密度生长阶段，控制重组毕赤酵母生长阶段的温度为30℃，使用25％氨水和30％磷酸调节pH，使体系的pH控制在5.5，并按预设时间加入10ng/ml-1μg/ml的褪黑激素；当发酵罐中甘油耗尽时，DO上升，以指数流加法流加含12mL/LPTM1的50％甘油，流速采用先上升后下降的方式，以通气量和搅拌转速控制DO在30％，直至菌体干重达到130g/L；在高效表达阶段，当补料生长阶段结束后，将发酵温度降至22℃，同时流加含12mL/LPTM1的100％的甲醇；控制发酵液中甲醇浓度达到20g/L，诱导90h后结束发酵。不仅可以用于改造任意目的基因以提高其表达效率，还可以用于构建具有高表达效率特征的表达载体，使目的基因的蛋白表达效率提高2～5倍。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。根据本专利技术实施例的第一个方面，提供一种提高蛋白表达效率的方法，包括：在高密度生长阶段，控制重组毕赤酵母生长阶段的温度为30℃，使用25％氨水和30％磷酸调节pH，使体系的pH控制在5.5，并按预设时间加入10ng/ml-1μg/ml的褪黑激素；当发酵罐中甘油耗尽时，DO上升，以指数流加法流加含12mL/LPTM1的50％甘油，流速采用先上升后下降的方式，以通气量和搅拌转速控制DO在30％，直至菌体干重达到130g/L；在补料生长阶段，F为补料流速，Fccm为连续培养基本补料培养基CCM的流速，Fm为甲醇培养基的流速，w1为CCM补料比例，单位为％(W/V)；F＝Fccm*w1+FmD＝F/V＝μD为稀释率，V为发酵液体积，μ为比生长速率，w1的值是根据单位菌体对基本补料培养基的需求量，预先确定的流加比例；在高效表达阶段，当补料生长阶段结束后，将发酵温度降至22℃，同时流加含12mL/LPTM1的100％的甲醇；控制发酵液中甲醇浓度达到20g/L，诱导90h后结束发酵。根据本专利技术实施例的第二个方面，提供一种提高蛋白表达效率的载体，包括如本专利技术实施例的第一个方面所述的毕赤酵母。本专利技术提出一种提高蛋白表达效率的方法及表达载体，包括：在高密度生长阶段，控制重组毕赤酵母生长阶段的温度为30℃，使用25％氨水和30％磷酸调节pH，使体系的pH控制在5.5，并按预设时间加入10ng/ml-1μg/ml的褪黑激素；当发酵罐中甘油耗尽时，DO上升，以指数流加法流加含12mL/LPTM1的50％甘油，流速采用先上升后下降的方式，以通气量和搅拌转速控制DO在30％，直至菌体干重达到130g/L；在高效表达阶段，当补料生长阶段结束后，将发酵温度降至22℃，同时流加含12mL/LPTM1的100％的甲醇；控制发酵液中甲醇浓度达到20g/L，诱导90h后结束发酵。不仅可以用于改造任意目的基因以提高其表达效率，还可以用于构建具有高表达效率特征的表达载体，使目的基因的蛋白表达效率提高2～5倍。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本专利技术的实施例的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本专利技术的实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本专利技术的实施例各实施例技术方案的范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高蛋白表达效率的方法，其特征在于，包括：在高密度生长阶段，控制重组毕赤酵母生长阶段的温度为30℃，使用25％氨水和30％磷酸调节pH，使体系的pH控制在5.5，并按预设时间加入10ng/ml‑1μg/ml的褪黑激素；当发酵罐中甘油耗尽时，DO上升，以指数流加法流加含12mL/LPTM1的50％甘油，流速采用先上升后下降的方式，以通气量和搅拌转速控制DO在30％，直至菌体干重达到130g/L；在补料生长阶段，F为补料流速，Fccm为连续培养基本补料培养基CCM的流速，Fm为甲醇培养基的流速，w1为CCM补料比例，单位为％(W/V)；F＝Fccm*w1+FmD＝F/V＝μD为稀释率，V为发酵液体积，μ为比生长速率，w1的值是根据单位菌体对基本补料培养基的需求量，预先确定的流加比例；在高效表达阶段，当补料生长阶段结束后，将发酵温度降至22℃，同时流加含12mL/LPTM1的100％的甲醇；控制发酵液中甲醇浓度达到20g/L，诱导90h后结束发酵。

【技术特征摘要】
1.一种提高蛋白表达效率的方法，其特征在于，包括：在高密度生长阶段，控制重组毕赤酵母生长阶段的温度为30℃，使用25％氨水和30％磷酸调节pH，使体系的pH控制在5.5，并按预设时间加入10ng/ml-1μg/ml的褪黑激素；当发酵罐中甘油耗尽时，DO上升，以指数流加法流加含12mL/LPTM1的50％甘油，流速采用先上升后下降的方式，以通气量和搅拌转速控制DO在30％，直至菌体干重达到130g/L；在补料生长阶段，F为补料流速，Fccm为连续培养基本补料培养基C...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷毅斌，吴娟，寇小娟，
申请(专利权)人：武汉巴菲尔生物技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42