The present invention relates to a method for producing recombinant proteins, which includes fermentation of prokaryotic host cells, in which the prokaryotic host cells have been transformed with nucleic acid encoding the recombinant proteins, harvested the recombinant proteins at a dO2 level greater than 0%, and purified into filtered reserves, which are measured at 310 nm by IEC method. The filtered reserves do not contain detectable DHNA recombinant protein adducts. In addition, a method for producing recombinant proteins is provided, which includes fermentation of prokaryotic host cells lacking menE gene, in which the prokaryotic host cells have been transformed with nucleic acid encoding the recombinant proteins, the recombinant proteins are harvested, and the recombinant proteins are purified into filtered reserves, where the filtered storage is measured at 310 nm by IEC assay. The preparation does not contain detectable DHNA recombinant protein adducts, which increase the yield of recombinant protein by about 20% or more.
【技术实现步骤摘要】
用于重组蛋白质的改进的收获操作本申请是中国专利申请201380027623.1的分案申请,原申请的申请日是2013年3月14日,专利技术名称是“用于重组蛋白质的改进的收获操作”。相关申请的交互引用本申请要求2012年3月27日提交的临时美国申请号61/616,297的优先权的权益,将所述申请以其整体并入本文作为参考。专利
本专利技术涉及用于在原核宿主细胞中培养重组蛋白质的改进方法。专利技术背景对于活的生物技术产品而言,蛋白质的大规模经济纯化是必须的。通常,使用哺乳动物或细菌细胞系,通过细胞培养产生蛋白质,通过插入含该蛋白质的基因的重组质粒来改造所述哺乳动物或细菌细胞系以产生目的蛋白质。由于所使用的细胞系是活的生物,所以必须使用复合生长培养基培养它们,所述复合生长培养基通常含有盐、糖、氨基酸、维生素、痕量元素和蛋白胨的混合物。从培养细胞的化合物的混合物中以及从细胞自身的副产物中分离期望的蛋白质达到足够用作为人类治疗剂的纯度是一种艰难的挑战。通常在几种宿主细胞系中产生重组治疗性蛋白质,包括哺乳动物宿主细胞例如,鼠骨髓瘤NS0和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Anderson,D.C和Krummen,L.(2002)Curr.Opin.Biotech.13:117-123;Chu,L.和Robinson,D.K.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:180-187)以及细菌宿主细胞包括大肠杆菌Escherichiacoli(E.coli)。就产率和由细胞产生的蛋白质的特征而言,每一细胞系都具有优点和缺点。大肠杆菌已经最广泛地用于治疗性蛋白质 ...
【技术保护点】
1.产生重组蛋白质的方法,其包括(a)发酵原核宿主细胞,其中已经用编码所述重组蛋白质的核酸转化所述原核宿主细胞,和(b)在溶解氧(dO2)水平大于0%的条件下收获所述重组蛋白质,以及(c)将所述重组蛋白质纯化成用于储存的经过滤的储备物(FBS),其中通过分析测定法如离子交换层析(IEC)测定法在310nm处所测量,所述经过滤的储备物不含可检测的1,4‑二羟基‑2‑萘甲酸(DHNA)‑重组蛋白质加合物。
【技术特征摘要】
2012.03.27 US 61/616,2971.产生重组蛋白质的方法,其包括(a)发酵原核宿主细胞,其中已经用编码所述重组蛋白质的核酸转化所述原核宿主细胞,和(b)在溶解氧(dO2)水平大于0%的条件下收获所述重组蛋白质,以及(c)将所述重组蛋白质纯化成用于储存的经过滤的储备物(FBS),其中通过分析测定法如离子交换层析(IEC)测定法在310nm处所测量,所述经过滤的储备物不含可检测的1,4-二羟基-2-萘甲酸(DHNA)-重组蛋白质加合物。2.权利要求1的方法,其中所述分析测定法是HPLC、RPHPLC、HICHPLC、NMR、质谱法或UV光谱学。3.权利要求1的方法,其中所述dO2在所述步骤(b)的收获操作中持续维持在大于0%的水平。4.权利要求3的方法,其中所述收获操作包括匀浆阶段。5.权利要去4的方法,其中所述dO2在匀浆之前维持在约30%至约75%。6.权利要求4的方法,其中所述dO2在匀浆之前维持在大于75%的水平。7.权利要求4或5的方法,其中所述dO2在匀浆后维持在约50%。8.权利要去4或5的方法,其中所述dO2在匀浆后维持在大于50%的水平。9.权利要求5的方法,其中维持所述dO2大于或等于1.5个小时。10.权利要求6的方法,其中维持所述dO2大于或等于2个小时。11.权利要求1的方法,其中用覆盖的或喷射的气体、用增加的反压或者用搅拌速率维持所述dO2。12.权利要求11的方法,其中所述覆盖的气体为约0.4vvm至约0.8vvm。13.权利要求12的方法,其中所述覆盖的气体为0.6vvm。14.权利要求11的方法,其中所述增加的反压为约1.0至30psi之间。15.权利要求14的方法,其中所述增加的反压为19psi。16.权利要求11的方法,其中所述搅拌速率为约6瓦特/L至约8瓦特/L。17.权利要求16的方法,其中所述搅拌速率为约6瓦特/L。18.权利要求1-17中任一项所述的方法,其中所述发酵是独立于规模的。19.权利要求1的方法,其中所述重组蛋白质是重组多肽或分离的抗体。20.权利要求1的方法,其中所述...
【专利技术属性】
技术研发人员:M·W·莱尔德,R·圣约翰,J·V·甘森,K·凯尔艾斯,D·纳达拉贾,R·亚当斯,B·R·斯内德克,
申请(专利权)人:弗·哈夫曼拉罗切有限公司,
类型:发明
国别省市:瑞士,CH
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