含有一个或几个点突变的头孢菌素C酰化酶突变体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及药物生产领域，具体涉及头孢类抗生素生产及其生产用酶，尤其地，涉及含有一个或几个点突变的头孢菌素C酰化酶突变体、编码其的核酸、相关表达载体和宿主细胞、其制备方法和所述突变体用于一步裂解CPC制备7‑ACA的用途。

【技术实现步骤摘要】
含有一个或几个点突变的头孢菌素C酰化酶突变体及其制备方法
本专利技术涉及药物生产领域，具体涉及头孢类抗生素生产及其生产用酶，更具体地，涉及含有一个或几个点突变的头孢菌素C酰化酶突变体、编码其的核酸、相关表达载体和宿主细胞、其制备方法和所述突变体用于一步裂解CPC制备7-ACA的用途。
技术介绍
7-ACA(7-aminocephalosporanicacid，7-氨基头孢烷酸)是一种非常重要的抗生素合成中间体，可以用来进行多种头孢类抗生素的合成，具有重要的医用价值。工业上，最早期采用化学裂解法裂解头孢菌素C(CephalosporinC，CPC)制备7-ACA，但是化学法的反应条件较为苛刻，反应过程必须在超低温条件下进行，且涉及大量的有毒有害的有机溶剂，会带来环境污染等问题。因此，近些年来对环境友好的酶法开始成为工业生产的新方向。早期工业化生产采用二步酶法进行催化，第一步，通过D-氨基酸氧化酶(DAO)将CPC转变为戊二基-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)；第二步，通过GL-7-ACA酰化酶将GL-7-ACA转变为7-ACA。但是，二步酶法催化时，第一步产生的过氧化氢与DAO底物或反应产物发生反应，产生大量的副产物，且其工艺过程长，控制难，成本高，因此现在更多地采用一步酶法催化CPC裂解反应。一步酶法催化反应采用的酶为头孢菌素C酰化酶(CephalosporinCacylase)，可直接催化CPC转变为7-APA。已在若干微生物中发现了对CPC有活性的CPC酰化酶，如假单胞菌属(PseudomonasSp.)、巨大芽胞杆菌杆菌(Bacillusmegaterium)、气单胞菌属(Aeromnassp.)、粘性节杆菌(Arthrobacterviscous)等，有些CPC酰化酶的基因已被克隆并测序，如假单胞菌属SE83来源的acyII基因(Matsuda等，J.Bacteriol.169：5821-5829,1987)；假单胞菌属N176来源的CPC酰化酶基因(US5192678)；假单胞菌属V22来源的CPC酰化酶基因(Aramori等，J.Ferment.Bioeng.72：232-243,1991)；泡囊假单胞菌(Pseudomonasvesicularis)B965来源的CPC酰胺水解酶基因(US6297032)；巨大芽孢杆菌来源的CPC酰胺酶基因(US5229274)；以及假单胞菌属130来源的CPC酰化酶基因(Li等，Eur.J.Biochem.262：713-719,1999)。然而，这些CPC酰化酶基因不具有足够的水解活性以裂解CPC第7位上的酰胺键，不适用于由CPC制备7-ACA的一步酶法。因此，为了获得可用于一步酶法制备7-ACA的CPC酰化酶，研究者们对野生型的CPC酰化酶进行了一系列的突变设计，如中国专利CN1836044B(头孢菌素C酰基转移酶突变体及用其制备7－ACA的方法)，要求保护CPC酰基转移酶突变体或其功能等效衍生物，其中CPC酰基转移酶α-亚基中的Val121α、Gly139α和Phe169α和CPC酰基转移酶β-亚基中的Met31β、Phe58β、His70β、Ile75β、Ile176β和Ser471β位点发生取代突变，这些突变体对CPC的反应性增强；CN103060298B(一种头孢菌素C酰化酶突变体及其编码基因与应用)，公开了K171S、M270W、I314S、L535T位点突变；CN102321603B(头孢菌素酰化酶突变体及其编码基因与应用)，涉及H296A、H309V位点突变等；CN102978192B要求保护V288M、H417G、H296等突变。一步酶法催化具有工艺过程短、环保、成本低的优势。然而，酶对温度较为敏感，反应最适温度在37-40℃左右。实际工业应用中为了降低反应过程的杂质生成，反应温度不宜超过25℃，一般维持在25到30℃，但此时酶活力较低，副产物仍较大，杂质较高，同时酶稳定性受到影响，使用批次也会相应减少。PseudomonasSp.SE83、PseudomonasSp.N176来源的头孢菌素C酰化酶作为AcyII类酰化酶，热稳定差，α亚基较大，虽然高温酶活力较高，但因其生产过程杂质较高，应用受到很大的限制。本专利技术的目的在于开发一种新型的耐低温、高活力、高稳定性的7-ACA生产用CPC酰化酶突变体，其可直接用于一步裂解CPC制备7-ACA。本专利技术选用α亚基较小(18KDa)的假单胞菌属130来源的的CPC酰化酶突变体进行一步酶法催化CPC生成7-ACA。该CPC酰化酶突变体可以在14-37℃下很好地催化底物CPC生成7-ACA反应，尤其在低温14℃反应时，酶活力下降仅30％，反应速度快，转化率高至99％以上，生成杂质低至0.3％，同时耐受45℃高温处理，稳定性高，最终制备的固定化酶重复批次可达400-800批，具有重大工业价值。
技术实现思路
本专利技术人通过大量的试验研究，提供了一种假单胞菌属(Pseudomonassp.)130来源的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物，所述CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物在SEQIDNO.1序列的基础上包含Iβ179Y突变。进一步地，所述的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物还包括选自以下的一个或几个点突变：Sβ3G、Pβ100V、Aβ136T、Nβ68S、Vβ70F、Mβ73I突变。进一步地，所述的头孢菌素C酰化酶突变体或其功能等效衍生物包含的一个或几个点突变中，Pβ100V被Pβ100Q所替代。更具体地，所述CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物的氨基酸序列与SEQIDNO.1序列相比，存在Iβ179Y突变(突变体1)；或Iβ179Y和Pβ100Q突变(突变体2)；或Iβ179Y和Pβ100Q和Sβ3G和Aβ136T突变(突变体3)；或Iβ179Y和Pβ100V和Sβ3G和Aβ136T突变(突变体4)；或Iβ179Y和Pβ100Q和Sβ3G和Aβ136T和Nβ68S和Vβ70F和Mβ73I突变(突变体5)；或Iβ179Y和Pβ100V和Sβ3G和Aβ136T和Nβ68S和Vβ70F和Mβ73I突变(突变体6)。氨基酸名称及缩写见表1表1氨基酸名称及缩写中文名称英文名称三字母缩写单字母缩写甘氨酸GlvcineGlyG丙氨酸AlanineAlaA缬氨酸ValineValV亮氨酸LeucineLeuL异亮氨酸IsoleucineIleI脯氨酸ProlineProP苯丙氨酸PhenylalaninePheF酪氨酸TyrosineTyrY色氨酸TryptophanTrpW丝氨酸SerineSerS苏氨酸ThreonineThrT半胱氨酸CysteineCysC蛋氨酸MethionineMetM天冬酰胺AsparagineAsnN谷氨酰胺GlutamineGlnQ天冬氨酸AsparticacidAspD谷氨酸GlutamicacidGluE赖氨酸LysineLysK精氨酸ArginineArgR组氨酸HistidineHisH本专利技术还提供了编码上述的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物的核酸、包含所述的核酸的表达载体及包含所述表达载体的宿主细胞。本专利技术所述的编码上述的CPC酰化酶突变体或其功能等本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种假单胞菌属(Pseudomonas sp.)130来源的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物，其特征在于，所述CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物在SEQ ID NO.1序列的基础上包含Iβ179Y突变。

【技术特征摘要】
1.一种假单胞菌属(Pseudomonassp.)130来源的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物，其特征在于，所述CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物在SEQIDNO.1序列的基础上包含Iβ179Y突变。2.根据权利要求1所述的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物，其特征在于，还包括选自以下的一个或几个点突变：Sβ3G、Pβ100V、Aβ136T、Nβ68S、Vβ70F、Mβ73I突变。3.根据权利要求2所述的头孢菌素C酰化酶突变体或其功能等效衍生物，其特征在于，Pβ100V被Pβ100Q点突变替代。4.根据权利要求1所述的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物，其特征在于，所述CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物的氨基酸序列与SEQIDNO.1序列相比，存在Iβ179Y突变；或Iβ179Y和Pβ100Q突变；或Iβ179Y和Pβ100Q和Sβ3G和Aβ136T突变；或Iβ179Y和Pβ100V和Sβ3G和Aβ136T突变；或Iβ179Y和Pβ100...

【专利技术属性】
技术研发人员：任丽梅，朱科，王翠，韩卫强，李红飞，王明晓，袁国强，
申请(专利权)人：石药集团圣雪葡萄糖有限责任公司，石药集团中奇制药技术石家庄有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13