一种N-糖酰胺酶D的异源表达及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程领域，公开一种N‑糖酰胺酶D的异源表达及其应用。N‑糖酰胺酶D在酶解糖蛋白上的N‑链寡糖中的应用，所述N‑糖酰胺酶D的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。本发明专利技术通过酶活性测定和底物特异性的分析，发现所述N‑糖酰胺酶D能作用于糖蛋白和糖肽，并最大限度酶切不同类型的N‑糖链结构，无自身糖基化污染，兼具了PNGase F和PNGase A两者优点的同时摒弃了它们的缺点。本发明专利技术利用基因工程手段克隆表达了重组N‑糖酰胺酶D，实现了N‑糖酰胺酶D的大量表达，获得了N‑糖酰胺酶D。

Heterologous expression of N-saccharidase D and its application

The present invention belongs to the field of bioengineering, and discloses a heterologous expression of N The application of N glucoamylase D in enzymatic hydrolysis of N chain oligosaccharides on glycoproteins. The amino acid sequence of N glucoamylase D is shown in SEQ NO.1. Through the determination of enzymatic activity and the analysis of the specificity of the substrate, it is found that the N -glucoamylase D can act on glycoproteins and glycopeptides, and digest different types of N -sugar chains to the maximum extent without self-glycosylation pollution. It has the advantages of both PNGase F and PNGase A, while discarding their shortcomings. The present invention clones and expresses recombinant N - glucoamylase D by means of genetic engineering, realizes large expression of N - glucoamylase D, and obtains N - glucoamylase D.

【技术实现步骤摘要】
一种N-糖酰胺酶D的异源表达及其应用
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种N-糖酰胺酶D的异源表达，生化特性优化及其应用。
技术介绍
糖组学研究是继基因组学和蛋白质组学之后的一个新的生物学研究热点，其中糖蛋白质聚糖是糖组学研究的重中之重。N-糖酰胺酶(PNGase)是N-连接糖基化研究中主要的工具酶，它能够将N-糖链完整地从其所连接的蛋白分子上释放下来，能够最大程度的保持糖链和蛋白结构的完整性，并在蛋白的糖基化位点上留下标记，为相关的后续研究提供最大化的信息。因此N-糖酰胺酶被广泛用于N-连接糖链结构信息的研究，糖链结构与功能关系的研究，糖链对糖蛋白功能的影响以及蛋白质结构分析等方面。目前应用最广泛的商业化N-糖酰胺酶主要有两种：分别是从甜杏仁提取的N-糖酰胺酶A(PNGaseA)和大肠杆菌表达的重组N-糖酰胺酶F(PNGaseF)，其反应过程如下图所示：但是这两种酶在使用中都有各自不可克服的缺点：PNGaseF不能酶切来源于植物或昆虫等核心结构上含有α1,3-岩藻糖的糖蛋白；PNGaseA作为一种糖蛋白，在高浓度条件下，会发生一定程度的自身去糖基化作用，在糖链分析中可能有影响实验结果的风险性，同时PNGaseA由于自身空间结构复杂，尚未有文献报道可以使用E.coli等原核表达系统对其进行重组表达。综上所述，现有的PNGaseF和PNGaseA两种酶各有优缺点，其并不能完全满足糖组学研究的需要，因此对N-糖酰胺酶进行进一步开发和研究十分有必要。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供N-糖酰胺酶D在酶解糖蛋白上的N-链寡糖中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种N-糖酰胺酶D，实现N-糖酰胺酶D的异源表达，相比于现有的商业N-糖酰胺酶，N-糖酰胺酶D具有更好的实用性。本专利技术的另一目的在于提供一种N-糖酰胺酶D的制备方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：N-糖酰胺酶D在酶解糖蛋白上的N-链寡糖中的应用。所述糖蛋白的来源包括动物、植物和微生物。上述N-糖酰胺酶D的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。一种用于酶解糖蛋白上N-链寡糖的N-糖酰胺酶D，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。用于表达上所述N-糖酰胺酶D的重组表达载体、转基因细胞系和转基因重组菌。所述的重组表达载体，采用以下方法制备：将如SEQIDNO.2所示N-糖酰胺酶D编码基因双酶切后连接至pRSF载体的NdeI和KpnI之间；得到大肠重组表达载体pRSF-DjPNGase。所述的转基因重组菌是将上述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达N-糖酰胺酶D的转基因重组菌；所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。一种制备N-糖酰胺酶D的方法，培养含有N-糖酰胺酶D编码基因的转基因细胞系或培养上述重组表达载体转化的转基因重组菌，诱导其表达，收获表达产物，得到粗酶，然后进行纯化得到纯酶形式的目的蛋白。上述的N-糖酰胺酶D在酶解核心结构上含有α1,3-岩藻糖的糖蛋白中的应用。一种酶解糖蛋白制备N-链寡糖的方法，是用上述的N-糖酰胺酶D将糖链从所连接的蛋白质分子上释放下来，得到游离态N-链寡糖。一种制备去糖基化蛋白的方法，是用上述的N-糖酰胺酶D将糖链从所连接的蛋白质分子上释放下来，得到去糖基化蛋白。上述N-糖酰胺酶D的异源表达，为如SEQIDNO.2所示N-糖酰胺酶D的编码基因在大肠杆菌中异源可溶性表达。上述的N-糖酰胺酶D在酶解多种标准糖蛋白上的N-链寡糖中的应用。所述标准糖蛋白为核糖核酸酶(RNaseB)、乳铁蛋白(Lactoferrin)和辣根过氧化物酶(HRP)。本专利技术涉及从一种粳稻(Dyellajaponica)中克隆的N-糖酰胺酶D基因。所述编码序列如SEQNO.2所示。本专利技术还涉及包含所述N-糖酰胺酶D编码序列的重组表达载体，N-糖酰胺酶D编码基因的核苷酸序列双酶切后连接至pRSF载体的NdeI和KpnI之间；得到大肠重组表达载体pRSF-DjPNGase。本专利技术还制备包含N-糖酰胺酶D编码基因的转基因重组菌，将重组好的表达载体pRSF-DjPNGase转化到大肠杆菌BL21(DE3)，构成表达pRSF-DjPNGase的转基因重组菌。将转基因重组菌通过正常的振荡培养，用IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白，通过超声裂解细胞，收获表达产物，表达产物利用Ni-NTA琼脂糖凝胶进行亲和纯化。对得到的纯化形式的N-糖酰胺酶D的活性使用不同类型标准糖蛋白：核糖核酸酶(RNaseB)、乳铁蛋白(Lactoferrin)和辣根过氧化物酶(HRP)进行测试。本专利技术还将N-糖酰胺酶D运用到释放多种植物糖蛋白N-链寡糖中，利用酸沉淀植物蛋白后加入N-糖酰胺酶D，得到多种不同类型的N-链寡糖，其结果如图1所示。本专利技术通过利用已经非常成熟的基因工程技术，通过基因搜索，克隆，重组表达和生化特性研究等获得了一种优质N-糖酰胺酶D。其能作用于糖蛋白和糖肽，并最大限度酶切不同类型的N-糖链结构，无自身糖基化污染，兼具了PNGaseF和PNGaseA两者优点的同时摒弃了它们的缺点。本专利技术的酶具有酶切含有1，3-核心岩藻糖的结构，PNGaseF却不能。本专利技术的酶可以在大肠杆菌中表达，不是糖蛋白，PNGaseA却不能。本专利技术的有益效果：本技术方案可以通过生物工程技术得到一种优质的N-糖酰胺酶D，其兼具了PNGaseF和PNGaseA两者优点的同时摒弃了它们的缺点，将为植物、昆虫糖组学N-糖链研究提供更经济实用的新工具，也为动物细菌等生物的糖组学研究提供更多的选择。附图说明图1为N-糖酰胺酶D酶切植物糖蛋白所得N-链寡糖结构图及N-链寡糖色谱图图2为N-糖酰胺酶D的Westernblot图图3为N-糖酰胺酶D底物特异性分析具体实施方式结合以下具体实施例，对本专利技术作进一步详细说明，本专利技术的保护内容不局限于以下实例。实验材料和试剂1、菌株和载体：常规菌种Dyellajaponica购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏号：DSM-16301。大肠杆菌Top10、BL21(DE3)级表达载体pRSF购自Novagen公司。2、酶类及其他生化试剂：限制性内切酶、DNAMarker、ProteinMarker购自TaKaRa公司；AxyPrep质粒提取试剂盒为Axygen公司产品。其他常规试剂为上海生工或南京寿德公司。3、本专利技术中所使用的生物化学技术均为本领域中的常规技术:在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的部分进行，包括：[美]J.沙姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)；朱检等，生物化学实验[M]，本专利技术中所有相关的酶或酶活性均指N-糖酰胺酶D。实施例1N-糖酰胺酶D基因的获得将N-糖酰胺酶D基因(SEQIDNO.2)送至南京金斯瑞公司进行合成。具体方法为采用基于PAS(PCR-basedAccurateSynthesis)的方法合成N-糖酰胺酶D的基因，设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基，通过克隆位点NdeI和KpnI连入表达载体pRSF，转入大肠杆菌Top10，过夜培养，挑取阳性克隆子测序。将测序结果与设计的预期序列进行比对，100％匹配，得到重组载体pRSF-DjPNG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.N‑糖酰胺酶D在酶解糖蛋白上的N‑链寡糖中的应用；所述N‑糖酰胺酶D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.N-糖酰胺酶D在酶解糖蛋白上的N-链寡糖中的应用；所述N-糖酰胺酶D的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种用于酶解糖蛋白上N-链寡糖的N-糖酰胺酶D，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.用于表达权利要求2所述N-糖酰胺酶D的重组表达载体、转基因细胞系和转基因重组菌。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体的制备方法为：将如SEQIDNO.2所示N-糖酰胺酶D编码基因双酶切后连接至pRSF载体的NdeI和KpnI之间；得到大肠重组表达载体pRSF-DjPNGase。5.根据权利要求3所述的转基因重组菌，其特征在于：所述的转基因重组菌是将权利要求3或4所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达N-糖酰胺酶D...

【专利技术属性】
技术研发人员：约瑟夫·弗戈迈，刘丽，杜雅珉，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32