一种构巢曲霉几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种构巢曲霉几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用。本发明专利技术根据毕赤酵母密码子偏爱性，利用全基因合成方法获得了构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中的几丁质脱乙酰酶编码基因序列，优化后的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。进一步利用毕赤酵母表达系统对该所述优化的几丁质脱乙酰酶编码基因进行分泌表达，获得构巢曲霉几丁质脱乙酰酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术获得的构巢曲霉几丁质脱乙酰酶可对壳聚糖及壳寡糖中的乙酰基进行脱除，从而获得特定结构的壳聚糖或壳寡糖。这些经调控后的壳聚糖或壳寡糖与调控前相比，可具有新的或更高的生物活性。因此，该酶及其脱乙酰产物均具有良好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种构巢曲霉几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用
本专利技术属于壳聚糖或壳寡糖制备
，具体涉及一种构巢曲霉(Bradyrhizobiumdiazoefficiens)几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用。
技术介绍
壳聚糖具有抗菌及激发动植物免疫等一系列生物活性。目前，主要通过化学法使用强碱对几丁质进行化学脱乙酰获得，容易造成环境污染。直接使用几丁质脱乙酰酶对几丁质进行脱乙酰有可能获得乙酰基位点分布可控的壳聚糖，且对环境友好。壳寡糖是甲壳素或者其脱乙酰产物壳聚糖经物理、化学或酶学等方法降解产生的寡聚物，由氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)、N-乙酰氨基葡萄糖(N-Acetylglucosamine，GlcNAc)或者二者的组合通过β-1,4糖苷键连接而成，通常聚合度(degreeofpolymerization，DP)<20。壳寡糖具有抗炎、抗肿瘤及激活植物免疫等一系列生物活性。研究发现，壳寡糖生物活性的发挥与其结构，如DP及脱乙酰度(Degreeofdeacetylation,DDA)甚至乙酰基在寡糖链上的分布等密切相关。因此，制备结构可控壳寡糖是该领域多功能及高活性新产品研发的新方向。利用不同底物识别类型的几丁质脱乙酰酶对几丁质、壳聚糖或壳寡糖进行脱乙酰，可以获得特定脱乙酰度及乙酰基位点分布的壳聚糖或壳寡糖，可能具有更高或新的生物活性。目前，尚缺乏工业用的几丁质脱乙酰酶制剂，限制了该领域的发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种构巢曲霉几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用；旨在提供一种经济高效的几丁质脱乙酰酶。本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案如下：本专利技术通过对构巢曲霉中的几丁质脱乙酰酶编码基因序列进行优化，以利于其在毕赤酵母中实现分泌表达，从而高效快速的获得脱乙酰活性高的几丁质脱乙酰酶。本专利技术提供的一种构巢曲霉几丁质脱乙酰酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：SEQIDNO.1：LEKREAEATPLPLVRRVPTGQVITQCTTPNTIALTFDDGPSEYTPQLLDLLSRYSARATFFVLGDAAAQNPGLLQRMRDEGHQVGAHTYDHVSLPSLGYDGIASQMTRLEEVIRPALGVAPAYMRPPYLETNELVLQVMRDLDYRVISASVDTKDYENQDADAIINTSFQLFLDQLDAGGNIVLAHDIHYWTVASLAERMLQEVNARGLIATTVGDCLGDGEIAWYH。本专利技术还提供了一种构巢曲霉几丁质脱乙酰酶基因，编码上述的构巢曲霉几丁质脱乙酰酶。优选地，所述构巢曲霉几丁质脱乙酰酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：SEQIDNO.2：Ctcgagaagagagaggctgaggctactccattgccattggttagaagagttccaactggtcaagttatcactcaatgtactactccaaacactatcgctttgactttcgacgacggtccatccgagtacactccacaattgttggacttgttgtccagatactccgctagagctactttcttcgttttgggtgacgctgctgctcaaaacccaggtttgttgcaaagaatgagagacgagggtcaccaagttggtgctcacacttacgaccacgtttccttgccatccttgggttacgacggtatcgcttcccaaatgactagattggaggaggttatcagaccagctttgggtgttgctccagcttacatgagaccaccatacttggagactaacgagttggttttgcaagttatgagagacttggactacagagttatctccgcttccgttgacactaaggactacgagaaccaagacgctgacgctatcatcaacacttccttccaattgttcttggaccaattggacgctggtggtaacatcgttttggctcacgacatccactactggactgttgcttccttggctgagagaatgttgcaagaggttaacgctagaggtttgatcgctactactgttggtgactgtttgggtgacggtgagatcgcttggtaccactaagcggccgcg。本专利技术还提供了包含上述构巢曲霉几丁质脱乙酰酶基因的重组表达载体。优选地，所述表达载体为pGBG1，表达载体pGBG1通过如下方式获得：通过对表达载体pPIC9中的信号肽序列(详见SEQIDNO.4所示)进行密码子优化，获得适合在毕赤酵母中表达的新的信号肽序列(详见SEQIDNO.5所示)，并利用NsiI/XhoI双酶切将SEQIDNO.5所示的信号肽序列替代原先的SEQIDNO.4所示信号肽，得到表达载体pGBG1。该表达载体pGBG1能够使目的蛋白在毕赤酵母中更高效的分泌表达。其中，表达载体pPIC9和毕赤酵母细胞GS115均为商业化产品。本专利技术所述的构巢曲霉几丁质脱乙酰酶的制备方法为：将上述的重组表达载体(例如，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的几丁质脱乙酰酶基因构建至表达载体中)导入毕赤酵母细胞，诱导并获得分泌表达的几丁质脱乙酰酶。优选地，所述毕赤酵母为GS115。进一步地，本专利技术所述构巢曲霉几丁质脱乙酰酶的具体制备步骤包括：(1)根据毕赤酵母密码子使用的偏好性，对来源于构巢曲霉的几丁质脱乙酰酶基因原始序列进行密码子优化；(2)将优化后的基因进行全合成并构建至表达载体pGBG1中；(3)对构建的表达载体进行酶切线性化后，舍弃含有抗性基因的片段，回收含有几丁质脱乙酰酶基因的片段并导入毕赤酵母细胞GS115中，诱导并获得分泌表达的几丁质脱乙酰酶。利用诱导表达的粗酶上清对壳寡糖底物进行水解并使用MALDI-TOF质谱方法对产物的组成进行分析。结果表明，本专利技术所述的构巢曲霉几丁质脱乙酰酶可单独用于壳聚糖或壳寡糖的脱乙酰；或者所述构巢曲霉几丁质脱乙酰酶与其他酶类，如几丁质脱乙酰酶、几丁质酶或壳聚糖等混合使用，协同制备特定结构壳聚糖或壳寡糖。本专利技术获得的构巢曲霉几丁质脱乙酰酶可对壳聚糖及壳寡糖中的乙酰基进行脱除，从而获得特定结构的壳聚糖或壳寡糖。这些经调控后的壳聚糖或壳寡糖与调控前相比，可具有新的或更高的生物活性。因此，该酶及其脱乙酰产物均具有良好的工业应用前景。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1.本专利技术的几丁质脱乙酰酶基因来源于构巢曲霉，使用巴斯德毕赤酵母表达系统分泌表达。构巢曲霉本身为非致病菌，而巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统也已被用于乳糖酶及磷脂酶C等食品级酶制剂的表达，其自身也被用于木聚糖酶的生产(GB2760-2014)。因此，使用构巢曲霉来源的几丁质脱乙酰酶基因在毕赤酵母中分泌表达，其产物几丁质脱乙酰酶可用于食品级壳聚糖或壳寡糖的生产。2.目前尚无商品化的几丁质脱乙酰酶，本专利技术可能填补该项空白，在新结构壳聚糖及壳寡糖制备领域取得较广泛应用。附图说明图1为本专利技术实施例中的重组表达载体ancda1-pGBG1及其酶切产物凝胶电泳图谱；图2为本专利技术实施例中含构巢曲霉几丁质脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构巢曲霉几丁质脱乙酰酶，其特征在于：所述构巢曲霉几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种构巢曲霉几丁质脱乙酰酶，其特征在于：所述构巢曲霉几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种构巢曲霉几丁质脱乙酰酶基因，其特征在于：编码权利要求1所述的构巢曲霉几丁质脱乙酰酶。3.根据权利要求2所述的构巢曲霉几丁质脱乙酰酶基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.包含权利要求2或3所述构巢曲霉几丁质脱乙酰酶基因的重组表达载体。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述表达载体为pGBG1，表达载体pGBG1通过如下方式获得：将表达载体pPIC9中的如SEQIDNO.4所示信号肽序列进行密码子优...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜昱光，焦思明，程功，张毓宸，冯翠，任立世，李建军，未金花，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11