本发明专利技术提供了一种苔藓PpHsp70基因和PpHsp70基因编码的叶绿体蛋白及其ATPase酶突变体PpHsp70m在提高植物耐高温、耐旱、耐盐胁迫等综合抗逆性中的应用。本发明专利技术通过对PpHsp70基因及其酶活突变体PpHsp70m在苔藓和水稻中的过表达转基因植株进行分子鉴定和胁迫试验，检测PpHsp70和PpHsp70m基因表达量变化及抗性改变等，结果发现与野生型相比，PpHsp70和PpHsp70m基因过表达转基因植株分别对高温、干旱和盐胁迫更耐受。这说明PpHsp70基因编码的蛋白质及其酶活突变体是影响植物综合抗逆性的关键因子，能够应用于植物抗逆品质改良中。
Application of a Mutant of Chloroplast Protein and ATPase Activity in Improving Plant Stress Resistance
The present invention provides a chloroplast protein encoded by Bryophyte PpHsp70 gene and PpHsp70 gene and its ATPase mutant PpHsp70m, which can be used to improve the comprehensive stress resistance of plants such as high temperature, drought and salt tolerance. By molecular identification and stress test of PpHsp70 gene and its enzyme mutant PpHsp70m overexpressed transgenic plants in moss and rice, the changes of expression and resistance of PpHsp70 and PpHsp70m gene were detected. The results showed that compared with wild type, PpHsp70 and PpHsp70m overexpressed transgenic plants were more tolerant to high temperature, drought and salt stress, respectively. This indicates that the protein and its enzyme mutant encoded by PpHsp70 gene are the key factors affecting plant comprehensive stress resistance and can be applied to improve plant stress resistance quality.
【技术实现步骤摘要】
一种叶绿体蛋白和ATPase酶活性突变体在提高植物抗逆性中的应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种PpHsp70基因和PpHsp70基因编码的叶绿体蛋白及其ATPase酶突变体PpHsp70m在提高植物综合抗逆性中的应用。
技术介绍
环境压力造成植物细胞水平上大量蛋白质机能失调，细胞广泛采取的最有效修复措施之一是热激蛋白(又叫伴侣蛋白，Hsps)与变性蛋白结合，维持蛋白质的可溶状态，帮助解折叠蛋白质重新组装成有活性的构像(2000)。最初是在热激条件下发现这类特异性蛋白的积累，直至今天，人们认识到它们所参与的细胞活动远远不止在热激处理下维护蛋白质的稳定构像。在植物中的研究显示，超量表达Hsp26显著增强拟南芥和水稻的耐热性(Xueetal.,2010；Kimetal.,2012)。玉米叶绿体sHsp26在高温和干旱联合处理下显著提高，干涉实验的蛋白质组分析表明sHsp26能够稳定叶绿体蛋白质组和PSII的蛋白质构像增强玉米的耐旱性(Huetal.,2010)。小立碗藓中至今仅一例关于Hsps参与非生物逆境胁迫的报道来自于PpHsp16.4，该基因响应脱落酸(ABA)、盐胁迫和水杨酸诱导，蛋白质通常以低聚复合体的形式聚集在叶绿体周围，对其研究证明小立碗藓的抗逆能力得自于逆境中保护细胞完整性逆境后修复重建机制(Ruibaletal.,2013)。Hsp70是真核生物广泛存在的一类伴侣蛋白，进化上结构和功能高度保守，主要行使帮助其他蛋白质折叠和组装、阻止蛋白质错误聚合、和帮助蛋白质跨膜转运的功能(Stetleretal.,2010)。Hsp70可以参与蛋白质折叠的内稳态以及与ATP结合和水解紧密结合的蛋白相互作用影响整个蛋白系统的稳定性(Preissleretal.,2017)，还会参与MEP途径中第一步酶错误折叠聚合后的降解，维持细胞功能的正常发挥(Llamasetal.,2017)。Hsp70家族在果蝇的发现已超过半个世纪(Ritossa,1962)，近年来人们逐渐认识到Hsp70家族在抗逆境方面的作用，玉米幼苗经100μMABA处理后H2O2水平迅速升高导致细胞质Hsp70显著累积引起抗旱性和抗高温能力增强(Huetal.,2010)。动物细胞(Guoetal.,2007)或植物细胞(Datetal.,2000；Mittler,2002)内均发现H2O2的积累会导致Hsp70家族成员大量表达，显示Hsp70参与细胞防护工作。Hsp70作为水解酶，具有水解ATP底物的能力，与Hsp40、GrpE组成一个系统共同完成前体蛋白质转运工作，Hsp40负责招募前体蛋白形成复合体，结合到Hsp70/ATP完成水解反应，所产生的能量驱动底物进入叶绿体基质GrpE协助释放出ADP，新的ATP进入Hsp70，开始下一个循环(Liuetal.,2014)。改变Hsp70水解酶的活性，是改变蛋白质活性和功能的一个重要方法。苔藓是最古老的陆生植物之一，是水生到陆生的过度植物，分化于4亿5千万年前，在进化地位上位于藻类之后、蕨类和种子植物之前，和微管植物属于单起源系统上的姐妹进化支，具有极其重要的研究地位。全世界约有苔藓植物21200种，遍布除海洋外的地球上每个角落，甚至生长于荒漠、冻原及岩石上，耐旱、耐寒、耐贫瘠，适应力极强，是大自然的先锋与拓荒者(Kidron,2014；曹同等，2014)。以苔藓进行逆境适应性研究已经成为抗逆研究的热点之一(Dohertyetal.,2017)，而利用苔藓来源的基因进行其他高等植物的抗逆改良及研究也在进行中(Liuetal.,2017)。以小立碗藓为对象开展的基因组学和分子生物学研究发现，为适应陆地生活，小立碗藓获得耐干旱基因、耐高温基因、感光基因、紫外修复基因等陆地胁迫响应基因(Rabaraetal.,2013；Rensingetal.,2008)。对我国多省大型铜矿和金矿生态环境破坏严重地区的植物资源调查发现，苔藓作为先锋植物在这些维管植物无法存活的地方生长。因此利用苔藓植物作为基因供体，具有普遍适应性，同时苔藓植物与其他高等植物共生的互不影响性，也为其在作物改良中的应用奠定了基础。可惜的是目前真正应用苔藓伴侣蛋白基因进行抗逆性遗传改良的案例非常少，能改良综合抗逆性的例子更是未见报道。本专利技术首次利用叶绿体伴侣蛋白和其酶活性改变突变体获得了多种植物的综合抗性材料，将为植物抵抗非生物胁迫，应对环境多样性变化和遗传工程改良提供理论和实践基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于对小立碗藓的叶绿体热激蛋白基因进行开发利用，提供一种PpHsp70基因或ATPase酶活性改变突变体在提高植物抗逆性中的应用。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案：PpHsp70基因或PpHsp70基因编码的叶绿体蛋白及其ATPase酶活性突变体在提高植物抗逆性中的应用。PpHsp70基因或PpHsp70基因编码的叶绿体蛋白及其ATPase酶活性突变体在提高植物耐高温、耐旱、耐盐胁迫中的应用。根据所述的应用，其中所述PpHsp70基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。根据所述的应用，其中所述PpHsp70基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。根据所述的应用，其中所述PpHsp70基因的ATPase酶突变体在原始PpHsp70第271个氨基酸位点发生了苏氨酸到丙氨酸T271A突变。根据任一项所述的应用，其中所述提高植物耐高温、耐旱、耐盐胁迫性是通过下述方法步骤得以实现的：(1)将前面所述编码序列连接于植物表达调控序列，形成植物表达载体；(2)将所述植物表达载体通过PEG介导的原生质体法导入小立碗藓，通过农杆菌侵染的方法转入水稻植物细胞，筛选得到转化细胞；(3)将所述转化细胞进行植株再生，鉴定后得到转基因阳性植株；(4)将所述转基因阳性植株进行抗逆性筛选和评价。根据所述的应用，其中所述植物为小立碗藓和水稻。根据所述的应用，其中所述抗逆性为抗高温、抗干旱和抗高盐。本专利技术同时还提供了一种提高植物抗逆性的方法，该方法包括如下步骤：(1)将PpHsp70基因ATP结合区第271个碱基点突变后获得PpHsp70m，测试ATPase酶活性；(2)将PpHsp70和PpHsp70m连接于植物表达调控序列，形成植物重组表达载体，分别为小立碗藓表达载体和水稻表达载体；(3)将所述植物重组表达载体通过PEG介导的原生质体转化方法导入小立碗藓细胞，筛选得到转化植株；(4)将所述植物重组表达载体通过农杆菌介导的方法转入水稻植物愈伤组织，筛选得到转化植株；(5)将所述得到的PpHsp70和PpHsp70m基因过表达的小立碗藓植株进行抗逆性筛选，获得抗性指标；(6)将所述得到的PpHsp70和PpHsp70m基因过表达的水稻植株T0代收获得到的种子发芽后苗期进行抗逆性筛选，获得抗性指标。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种PpHsp70和ATPase酶活突变体PpHsp70m基因或基因编码的蛋白质在提高植物抗逆性中的应用。本专利技术通过对PpHsp70过表达转基因植株进行分子鉴定和非生物逆境胁迫试验，检测其基因表达量及抗性改变等。结果发现：与野生型相比，小立碗藓过表达转基因植株对高温、干本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.PpHsp70基因或PpHsp70基因编码的叶绿体蛋白及其ATPase酶活性突变体在提高植物抗逆性中的应用。
【技术特征摘要】
1.PpHsp70基因或PpHsp70基因编码的叶绿体蛋白及其ATPase酶活性突变体在提高植物抗逆性中的应用。2.PpHsp70基因或PpHsp70基因编码的叶绿体蛋白及其ATPase酶活性突变体在提高植物耐高温、耐旱、耐盐胁迫中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述PpHsp70基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述PpHsp70基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述PpHsp70基因的ATPase酶突变体在原始PpHsp70第271个氨基酸位点发生了苏氨酸到丙氨酸T271A突变。6.根据权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于，所述提高植物耐高温、耐旱、耐盐胁迫性是通过下述方法步骤得以实现的：(1)将权利要求3和5所述编码序列连接于植物表达调控序列，形成植物表达载体；(2)将所述植物表达载体通过PEG介导的原生质体法导入小立碗藓，通过农杆菌侵染的方法转入水稻植物细胞，筛选得到转化细胞；(3)将...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘莉，杨红，李萍，袁文雅，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53
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