蜡梅CpVIN3基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供蜡梅CpVIN3基因及其在花期调控中的应用。本发明专利技术提供的蜡梅CpVIN3的基因序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术首次克隆获得蜡梅CpVIN3基因，并通过转基因技术，在植物拟南芥中验证了该基因的功能。通过将CpVIN3基因转入拟南芥，对其表型进行观察来初步验证该基因功能，对比转基因与野生型拟南芥表型发现，在4℃春化处理的条件下，转基因型拟南芥的开花时间比野生型拟南芥提前，莲座叶数量与野生型相比减少，说明该基因在春化作用诱导成花过程中调节植物营养生长向生殖生长的转化。

CpVIN3 Gene of Chimonanthus praecox and Its Application

The invention provides CpVIN3 gene of Chimonanthus praecox and its application in florescence regulation. The gene sequence of CpVIN3 provided by the invention is shown as SEQ ID No.1. The CpVIN3 gene of Chimonanthus praecox was cloned for the first time, and its function was verified in plant Arabidopsis thaliana by transgenic technology. CpVIN3 gene was transformed into Arabidopsis thaliana and its phenotype was observed to preliminarily verify its function. Compared with the phenotype of wild-type Arabidopsis thaliana, it was found that the flowering time of transgenic Arabidopsis thaliana was earlier than that of wild-type Arabidopsis thaliana under the condition of vernalization at 4 C, and the number of lotus leaves was less than that of wild-type Arabidopsis thaliana, which indicated that the gene regulated the flowering process during the vernalization induction. The transformation from vegetative growth to reproductive growth.

【技术实现步骤摘要】
蜡梅CpVIN3基因及其应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，涉及蜡梅CpVIN3基因的克隆及其应用。
技术介绍
蜡梅(Chimonanthuspraecox(L.)Link)是一种我国特有的冬季开花多年生灌木，因其色如蜜蜡，芳香馥郁而声名远播，傲雪绽放的特性使它成为深受人们喜爱的园林观赏植物，在我国几千年的历史长河中，蜡梅在苗圃和盆景中的栽培和种植别具一格。除此之外，蜡梅是第四纪冰川孑遗植物，在古老的进化系统中占据重要地位[2]。数百年来，人们对蜡梅的研究主要集中在种质资源、品种类别和栽培种植等方面，近年，随着分子生物学的蓬勃发展，人们对蜡梅的认识也逐渐转入分子水平。近年来，对蜡梅基因的分子克隆发展迅速，研究领域集中在抗逆性及开花机制等方面。此外，眭顺照等人利用EST技术构建了第一个蜡梅花的cDNA文库，就此分析蜡梅开花过程中的基因表达，以此为基础先后克隆出蜡梅花发育相关的不同基因，并分析其表达特性：如蜡梅冷适应蛋白基因Cpcor413pm1，使烟草的耐寒性得到了极大提高；蜡梅胰蛋白酶抑制基因CpKTI，使植物抗虫性增强；与植物的极性生长、抗病抗逆性、激素信号传导、活性氧的产生以及细胞的凋亡等密切相关的基因CpRAC1；胚胎发育晚期富积蛋白基因CpLEA基因，主要在种子成熟和发育阶段表达，是一类低分子量蛋白，在花粉粒或植物根叶中干旱、高盐或低温情况下，LEA蛋白表达量显著增加。蜡梅Patatin-like蛋白基因CpPLP植物防御病虫害的一种手段，而且还能提高植物应对干旱胁迫的能力。蜡梅CpEXP1基因的表达与蜡梅花蕾脱落存在一定的相关性。热激蛋白CpHSP70-1和CpHSP70-2基因在正常情况下与应激条件下都能发挥重要的生理功能。基于对上述蜡梅基因功能的初步了解，为蜡梅基因克隆及功能的研究奠定了一定基础。通过对春化作用拟南芥功能缺失突变体的研究，初步揭示了春化作用的分子机制。在拟南芥中已发现6个与春化作用直接相关的基因VIN3、VRN1，VRN2，VRN3，VRN4和VRN5。在VIN3突变体植株中，低温处理并不能影响FLC的表达量，这表明VIN3直接抑制了FLC基因的表达。更重要的是VIN3的诱导需要一定时间的低温处理，直到VIN3被诱导，FLC方能被抑制。VIN3的表达受温度的控制，当温度不足以使VIN3被激活时，FLC也不会被抑制，并且VIN3的表达部位仅仅只在茎尖和根尖，这与FLC的表达位点一致。当VIN3被诱导表达后迅速抑制FLC的表达，而当植株由春化的低温条件转到正常生长环境后，VIN3的诱导迅速关闭。因而VIN3的作用是在春化过程中识别低温，进而抑制FLC的表达。VIN3基因编码一个PHD锌指结构蛋白能够改变染色质的空间结构从而使基因沉默，引起FLC功能钝化，消除其对植物开花的抑制效应。研究发现，春化作用诱导VIN3的表达，VIN3与VRN1和VRN2共同形成春化复合体，作用于FLC染色质组蛋白的H3K9和H3K27使其发生二甲基化和三甲基化修饰，以及H3K9和H3K14的去乙酰化等修饰，引起染色质结构的重塑，使植株表现为早花。而在突变体中，H3K9和H3K14并未发生去乙酰化的变化。VIN3所编码的蛋白本身没有去乙酰化酶的活性。VRN1编码Myb相关的DNA结合蛋白，VRN2编码PRC2蛋白。VRN1和VRN2的表达情况并不受春化作用的影响，在VRN1和VRN2的突变体中，春化处理条件下，由于VIN3的作用，FLC的表达明显降低，但当回暖后，FLC的表达又迅速升高。这表明VRN1和VRN2并不是在春化过程中起作用，而是继VIN3作用后，在植株回到正常温度环境下时，维持对FLC的抑制。蜡梅是我国特有的观赏植物，但其特有的冬季开花机制尚不明确。蜡梅的开花与春化作用密切相关，VIN3基因是影响春化作用的关键基因。在目前的研究中，人们已经全面地了解了拟南芥、甘蓝等模式植物中VIN3的功能和作用机制，但是在蜡梅中CpVIN3的相关报道还未出现，且对其功能及作用有着许多猜想，需进行大量的实验加以证实。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供蜡梅CpVIN3基因及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的蜡梅CpVIN3蛋白，其为：1)由SEQIDNo.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或，2)在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本专利技术还提供编码蜡梅CpVIN3蛋白的基因，序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术还提供含有CpVIN3基因的载体、宿主细胞及工程菌。本专利技术还提供CpVIN3基因在春化作用中促进植物开花的应用。具体地，将所述CpVIN3基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达。本专利技术还提供CpVIN3基因在制备转基因植物中的应用。本专利技术进一步提供一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有CpVIN3基因的载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。本专利技术具有以下优点：通过分析转录组数据库，首次克隆获得蜡梅春化基因CpVIN3的序列。该cDNA序列全长2045bp，含735bp的最大开放阅读框，编码244个氨基酸的蛋白质，具有PHD锌指蛋白的保守结构域，属于PHD锌指蛋白家族成员，与其他已知植物的VIN3蛋白同源性较高，其中与棕榈科的海枣(Phoenixdactylifera)相似性最高为63％，系统进化分析显示植物的VIN3蛋白具有较高的种属特异性，各属植物的VIN3蛋白聚在同一支。蜡梅VIN3与海枣亲缘关系最近。通过将CpVIN3基因转入拟南芥，对其表型进行观察来初步验证该基因功能，对比转基因与野生型拟南芥表型发现，在4℃春化处理的条件下，转基因型拟南芥的开花时间比野生型拟南芥提前，莲座叶数量与野生型相比减少，说明该基因在春化作用诱导成花过程中调节植物营养生长向生殖生长的转化。附图说明图1所示为蜡梅CpVIN3基因的克隆。M：DNA分子量标准DL2000；1：ddH2O阴性对照；2：花蕾cDNA模板。图2所示为蜡梅CpVIN3测序结果的BLASTx比对。图3所示为几种不同真核生物VIN3进化树分析。Jc：麻风树JatrophacurcasKDP41489.1；Rc：蓖麻RicinuscommunisEEF48634.1；Me：木薯ManihotesculentaOAY51124.1；Pe：胡杨PopuluseuphraticaXP_011016245.1；Cf：土瓶草CephalotusfollicularisGAV66844.1；Cs：甜橙CitrussinensisXP_006477120.1；Mn：桑树MorusnotabilisEXC52458.1；Nn：莲NelumbonuciferaXP_010254558.1；Vv：葡萄VitisviniferaXP_002283776.2；Nt：烟草NicotianatabacumXP016492646.1；So：菠菜SpinaciaoleraceaKNA15275.1；Pd：海枣PhoenixdactyliferaXP_008805929.1；Eg：油棕ElaeisguineensisXP_010941720.1；Ao：石刁柏Asparaoffici本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蜡梅CpVIN3蛋白，其为：1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.蜡梅CpVIN3蛋白，其为：1)由SEQIDNo.2所示的氨基酸组成的蛋白质2)在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述的蜡梅CpVIN3蛋白的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQIDNo.1所示。4.含有权利要求2或3所述基因的载体。...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志能，张弈，眭顺照，李名扬，李先源，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50