一种SAA蛋白免疫原及其制备方法和抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体技术

本发明专利技术涉及免疫领域，具体而言，涉及一种SAA蛋白免疫原及其制备方法和抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体。一种SAA免疫原的制备方法，所述SAA蛋白采用蛋白交联剂溶液处理形成SAA聚合体，得到SAA免疫原。现有的SAA蛋白稳定性较差，并且原核表达的SAA蛋白免疫原性差，本发明专利技术发现，对SAA蛋白采用蛋白交联剂溶液处理形成SAA聚合体，获得跟天然结构类似的SAA蛋白，免疫原性强，稳定性显著提高。

AN IMMUNOGEN OF SAA PROTEIN AND ITS PREPARATION METHOD AND ANTI-HUMAN SERUM AMYLOID PROTEIN A POLYCLONAL ANTIBODY

The invention relates to the field of immunity, in particular to a SAA protein immunogen and a preparation method thereof and a polyclonal antibody against human serum amyloid protein A. A preparation method of SAA immunogen is provided. The SAA protein is treated with protein crosslinking agent solution to form SAA polymer, and the SAA immunogen is obtained. The present SAA protein has poor stability and poor immunogenicity of the prokaryotic SAA protein. The present invention finds that the SAA protein is treated with protein crosslinking agent solution to form SAA polymer, and the SAA protein with similar natural structure is obtained, which has strong immunogenicity and remarkable stability.

【技术实现步骤摘要】
一种SAA蛋白免疫原及其制备方法和抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体
本专利技术涉及免疫领域，具体而言，涉及一种SAA蛋白免疫原及其制备方法和抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体。
技术介绍
抗原通常是由多个抗原决定簇组成。由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原刺激所产生的抗体称之为单克隆抗体(Moncloneantibody)。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体(polyclonalantibody)。人血清淀粉样蛋白A(serumamyloidAprotein，SAA)，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，相对分子量约12000Da。SAA是一个多态性蛋白的总称，由几个相关但各具独立基因的蛋白(SAA1、SAA2、SAA3和SAA4)组成。其中人SAA1和人SAA2蛋白只有5个氨基酸的差别，它们均编码急性期SAA蛋白，在炎症反应中作用相近。人SAA3是一个假基因，人SAA4(组成型蛋白，C-SAA4)在急性期反应中变化不大，是一个在动态平衡中与高密度脂蛋白胆固醇一起出现的异形物。正常情况下，C-SAA占体内总量的90％，是载脂蛋白总量的1％—2％，急性实相反应时，机体产生的促炎因子合成大量SAA1-SAA2(即A-SAA)，A-SAA释放入血，而促炎因子并不刺激C-SAA的表达升高，其仍呈低水平表达并结合于HDL3上，不受A-SAA表达升高的影响，因此主要是A-SAA在体内参与机体的各种生理、病理反应。与C反应蛋白(C-reactiveprotein，CRP)类似，SAA蛋白的浓度是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标，有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗。但是，SAA蛋白的检测在诊断发生病毒感染、肾移植排斥反应的患者(特别是进行免疫抑制治疗的患者)以及用肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面，比CRP蛋白更确凿。联合检测CRP和SAA蛋白能够有效区分感染性疾病的类型。鉴于SAA在临床治疗及诊断中的重要性，目前国内外对SAA的研究越来越重视。目前普遍用大肠杆菌表达系统，表达SAA-6His及hSAA蛋白。SAA的体外重组表达及纯化具有一定的优点，如其表达量较高，在不同表达条件下，在上清和包涵体中均有表达，纯化方法简单等。但另一方面，重组表达的SAA蛋白非常容易形成聚集与降解，在体外的稳定性非常不好，并且不容易获得具有天然结构的SAA蛋白，这些缺点大大地限制了SAA的应用。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种SAA免疫原及其制备方法，通过蛋白交联剂溶液对SAA蛋白处理，形成SAA聚合体，得到的SAA免疫原的免疫原性以及稳定性提升显著。本专利技术的第二目的在于提供一种抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体，采用上述的SAA免疫原对宿主免疫，得到的多克隆抗体。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种SAA免疫原的制备方法，所述SAA蛋白采用蛋白交联剂溶液处理形成SAA聚合体，得到SAA免疫原。现有的SAA蛋白稳定性较差，并且原核表达的SAA蛋白免疫原性差，本专利技术发现，对SAA蛋白采用蛋白交联剂溶液处理形成SAA聚合体，获得跟天然结构类似的SAA蛋白，免疫原性强，稳定性显著提高。蛋白质交联剂是一类小分子化合物，具有2个或者更多的针对特殊基团(-NH2、-COOH、-HS等)的反应性末端，可以和2个或者更多的分子分别偶联，从而使这些分子结合在一起。人血清淀粉样蛋白A(serumamyloidAprotein，SAA)，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，相对分子量约12000Da。其蛋白家族包含4个成员，分别是SAA1、SAA2、SAA3和SAA4，其中SAA1与SAA2蛋白极其相似，它们只有5个氨基酸的差别，且这两种均与炎症相关。SAA3是假基因，不编码蛋白，而SAA4是组成型蛋白。并且，SAA1蛋白占A-SAA总组成成分的百分之八十以上，因此，本专利技术选择SAA1基因对应的蛋白制备。进一步地，所述SAA蛋白为SAA1基因对应表达的蛋白。在一些实施例中，所述蛋白交联剂选自1-乙基-3(3-二甲氨丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛、琥珀酸酐中的任一种。在一些实施例中，所述蛋白交联剂为戊二醛，所述处理采用的戊二醛溶液的质量浓度为0.3％-1.2％，优选为0.6％-1％，更优选为0.6％-0.8％。在一些实施例中，所述戊二醛溶液处理为：4±2℃反应2-3h；优选为2-4℃反应2.5h。在一些实施例中，所述戊二醛溶液处理后还包括终止步骤。在一些实施例中，所述终止采用加入NaHB4进行。在一些实施例中，加入终浓度为50mMTris-HCl(pH8.8)和10mMNaHB4，终止反应8-15h。在一些实施例中，所述SAA蛋白采用蛋白交联剂溶液处理时，所述SAA蛋白处于含有NaCl的PB中；其中，所述PB的浓度为20mM，pH8.0；NaCl的浓度为100mM。在一些实施例中，终止完成后，聚合后的蛋白样透析至含有NaCl的Tris-HCl溶液中；其中，Tris-HCl的浓度为25mM，pH8.0；NaCl的浓度为100mM。在一些实施例中，终止完成后，聚合后的蛋白样透析的透析比大于10000:1。在一些实施例中，所述SAA蛋白为人血清淀粉样蛋白A的SAA1基因进行原核表达的蛋白，所述SAA1基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1所示。在一些实施例中，所述原核表达所用的菌为大肠杆菌或枯草杆菌。进一步地，所述大肠杆菌选自E.coliBL21(DE3)、E.coliBL21(DE3)plys、BLR(DE3)、B834、DH5α、HB101或JM109。在一些实施例中，所述原核表达所用的原核表达载体选自pET28a、pET28b、pET28c、pET32、pMAL、pKK、pBAD或pBV22。进一步地，所述原核表达所用的表达载体为融合型原核表达载体，包括：启动子、纯化标签基因、蛋白酶切割位点、多克隆位点和终止子；在纯化标签基因和蛋白酶切割位点之间连接有SAA1基因；多克隆位点位于蛋白酶切割位点和终止子之间。在一些实施例中，所述纯化标签基因位于启动子的下游；进一步地，所述启动子包括lac启动子、trp启动子、P1启动子、由lac启动子-10区和trp启动子-35区融合形成的tac启动子、Tn5启动子中的任一种；进一步地，所述纯化标签包括his标签、avidin标签、t7标签、Trx标签和myc标签中的任一种或多种。进一步地，所述蛋白酶切割位点的蛋白酶包括PSP酶、肠激酶或凝血酶中的任一种。在一些实施例中，所述原核表达的蛋白采用以下方法制备：含有SAA1基因的载体的原核生物诱导表达，裂解，得到重组SAA蛋白；所述重组SAA蛋白经沉淀、复溶、柱分离，得到的洗脱液，所述洗脱液进行透析，得到含有目的蛋白的透析液；对所述目的蛋白进行酶切，酶切后的蛋白进行反亲和处理、再生处理和柱分离，即得。本专利技术还提供了上述的方法制得的SAA免疫原。经检测，得到的SAA免疫原与天然SAA蛋白具有类似的结构，并且稳定性明显增强。本专利技术还提供了一种抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体，采用上述的SAA免疫原对宿主免疫得到。进一步地，所述宿主包括为兔、大鼠、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种SAA免疫原的制备方法，其特征在于，所述SAA蛋白采用蛋白交联剂溶液处理形成SAA聚合体，得到SAA免疫原；进一步地，所述SAA蛋白为SAA1基因对应表达的蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种SAA免疫原的制备方法，其特征在于，所述SAA蛋白采用蛋白交联剂溶液处理形成SAA聚合体，得到SAA免疫原；进一步地，所述SAA蛋白为SAA1基因对应表达的蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白交联剂选自1-乙基-3(3-二甲氨丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛、琥珀酸酐中的任一种。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白交联剂为戊二醛，所述处理采用的戊二醛溶液的质量浓度为0.3％-1.2％，优选为0.6％-1％，更优选为0.6％-0.8％；进一步地，所述戊二醛溶液处理为：4±2℃反应2-3h；优选为2-4℃反应2.5h；进一步地，所述戊二醛溶液处理后还包括终止步骤；进一步地，所述终止采用加入NaHB4进行：进一步地，加入终浓度为50mMTris-HCl(pH8.8)和10mMNaHB4，终止反应8-15h；进一步地，所述SAA蛋白采用蛋白交联剂溶液处理时，所述SAA蛋白处于含有NaCl的PB中；其中，所述PB的浓度为20mM，pH8.0；NaCl的浓度为100mM。进一步地，终止完成后，聚合后的蛋白样透析至含有NaCl的Tris-HCl溶液中；其中，Tris-HCl的浓度为25mM，pH8.0；NaCl的浓度为100mM；进一步地，终止完成后，聚合后的蛋白样透析的透析比大于10000:1。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述SAA蛋白为人血清淀粉样蛋白A的SAA1基因进行原核表达的蛋白，所述SAA1基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1所示。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述原核表达所用的菌为大肠杆菌或枯草杆菌；进一步地，所述大肠杆菌选自E.co...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋文超，刘春艳，夏昌校，代双，柯拓，郑长生，杨耿周，夏良雨，
申请(专利权)人：广东菲鹏生物有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44