一种检测食品基质中黄曲霉毒素的前处理方法技术

本发明专利技术提出一种检测食品样品基质中黄曲霉毒素的前处理方法。它包括以下步骤：称取均质化的食品样品置于乙腈‑水溶液涡旋振摇提取，离心分层，取一定体积提取液，依次加入萃取剂二氯甲烷，衍生试剂三氟乙酸，混匀后加入到一定体积水中，置于水浴中反应，提取液中的黄曲霉毒素被萃取到二氯甲烷中，同时被三氟乙酸衍生，反应结束后，取下层液体氮吹，复溶于一定体积的乙腈‑水体系中，获得上样液。用高效液相色谱‑荧光检测在等度条件下实现对于食品基质中黄曲霉毒素的分离检测。

A Pretreatment Method for the Detection of Aflatoxin in Food Matrix

The invention provides a pretreatment method for detecting aflatoxin in food sample matrix. It consists of the following steps: weighing homogenized food samples and putting them into the eddy vibration extraction of acetonitrile-water solution, centrifugal stratification, taking a certain volume of extract, adding extractant dichloromethane in turn, derivative reagent trifluoroacetic acid, mixing them into a certain volume of water, and then reacting in water bath. Aflatoxin in the extract is extracted into dichloromethane, and at the same time it is extracted by trifluoroacetic acid. After the reaction, the lower liquid nitrogen was blown and dissolved in a certain volume of acetonitrile-water system to obtain the upper sample solution. The separation and detection of aflatoxins in food substrates were realized by high performance liquid chromatography and fluorescence detection under the same conditions.

【技术实现步骤摘要】
一种检测食品基质中黄曲霉毒素的前处理方法
本专利技术涉及样品前处理领域，具体地涉及一种检测食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的样品前处理方法。
技术介绍
黄曲霉毒素(AFS)是一种分子真菌毒素，它被称为最强的天然致癌物质，1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构定为Ⅰ类致癌物。黄曲霉毒素广泛存在于霉变的粮食产品中，检测农产品和食品中的黄曲霉毒素是国际性重要问题。目前分离出来的黄曲霉毒素有十多种，主要有B1(AFB1)、B2(AFB2)、G1(AFG1)、G2(AFG2)、M1(AFM1)。其中，B1的毒性最强，约是氰化钾的10倍，是三氧化二砷(砒霜)的68倍。黄曲霉毒素前处理方法主要有液液萃取(LLE)，固相萃取(SPE)，多功能净化柱净化，免疫亲和(IAC)柱净化；但是目前的前处理方法普遍存在操作步骤繁琐，样品损失严重，耗时长，且需要消耗大量的有机溶剂，回收率不高；基于免疫亲和的原理来实现净化除杂，虽然能够实现较好的净化效果，但是该方法的成本较高，难以被实验室普及使用。液液分散微萃取(DLLME)作为一种前处理方法，也逐渐应用于黄曲霉毒素前处理净化除杂，但是黄曲霉毒素B1和G1本来具有较强的荧光，但其与水接触后，会有荧光淬灭现象发生，因此液液分散微萃取净化除杂后，还需要氮吹，在正己烷体系下采用三氟乙酸进行衍生。传统的DLLME方法，存在操作步骤繁琐，耗时长，难以实现快速净化除杂，因此建立一种快速、准确、方便和经济的黄曲霉毒素的前处理净化方法，有利于监控食品、调味品、饲料和茶叶中黄曲霉毒素的含量，从而保障食品安全。专利技术内容本专利技术所要解决的技术问题在于克服传统样品前处理方法使用亲和柱净化、繁琐耗时、消耗大量有机溶剂、分析成本高的缺点，提供一种方便快速、易于实现、低成本检测多种黄曲霉毒素的样品前处理方法，满足当下对于黄曲霉毒素快速低成本的检测需求。为实现上述目的，本专利技术提出以下技术方案：一种检测食品基质中黄曲霉毒素的前处理方法，包括以下步骤：a)样品提取：称取均质化的食品样品置于提取溶剂中涡旋振摇提取，离心分层，获得提取液；b)原位衍生-液液分散微萃取：取一定体积提取液，依次加入萃取剂二氯甲烷和衍生试剂三氟乙酸，混匀后加入到一定体积的水中，形成乳浊液，将其置于水浴中反应；提取液中的黄曲霉毒素被萃取到二氯甲烷中，同时被三氟乙酸衍生；反应结束后，有机相和水相分层，下层是有机相，上层是水相；c)将下层有机相转移至容器中，氮吹干并复溶于乙腈/水溶剂中，获得上样溶液，所述上样溶液直接用于液相色谱-荧光检测法检测黄曲霉毒素。所述步骤a)中提取溶剂为乙腈或乙腈-水混合溶液，其中乙腈的体积分数≥50％。所述步骤b)中的提取液和水的体积比是1:2～1:10；衍生试剂三氟乙酸与步骤a)中的食品样品的质量比为1:1～5:2。所述步骤c)中的复溶溶剂为乙腈-水混合溶液，其中乙腈的体积分数为10％～30％。所述黄曲霉毒素为黄曲霉B1、B2、M1、M2、G1和G2。所述步骤a)中食品样品和提取溶剂的质量比是1:3～1:8。所述步骤a)中的提取时间为10-40min，所述离心条件为4000～6000r/min条件下离心1-5min。所述步骤b)中的水浴温度是30-50℃，反应时间为5-20min。本专利技术的技术优势：1、传统的黄曲霉毒素-三氟乙酸的衍生反应是在正己烷环境下实现，但是正己烷溶剂与分散液液微萃取过程是不兼容的，无法作为分散液液微萃取的萃取剂，因此传统的分散液液微萃取-衍生方法无法实现萃取-衍生一体化。本专利技术通过大量实验验证，发现二氯甲烷可以作为黄曲霉毒素-三氟乙酸的衍生溶剂环境，尽管现有技术和实验结果均表明，黄曲霉毒素在二氯甲烷中的衍生效率比在正己烷中的衍生效率低，但由于本专利技术将分散液液微萃取与衍生反应集成于一体，在水-乙腈-二氯甲烷乳浊液体系中形成了微液滴，增加了萃取相的比表面积，黄曲霉毒素被萃取到微液滴中，并同时在微液滴内被衍生。这种微区萃取-衍生反应提高了局部反应浓度，加快了黄曲霉毒素的反应速率，促使水相中的黄曲霉毒素不断向二氯甲烷相转移。最终获得的萃取衍生效率是传统方法(在正己烷中进行衍生)的10倍以上，取得非常好的效果。2、该前处理减少约50％有机溶剂的使用，节省了前处理操作步骤，简单高效；3、该前处理方法对实际样品的回收率高达85％以上，重复性RSD小于10％，定量结果准确；4、该前处理方法普适性好，适用于粮食、坚果、植物油等多种食品基质中黄曲霉毒素的检测；5、该前处理方法获得的上样溶液适用于各类高效液相色谱-荧光检测仪。附图说明图1为花生样品基质加标黄曲霉毒素色谱图；图中：1-黄曲霉毒素G1，2-黄曲霉毒素B1，3-黄曲霉毒素G2，4-黄曲霉毒素B2。具体实施方式一种检测食品基质中黄曲霉毒素的前处理方法，其特征在于：a)样品提取：称取适量均质化的食品样品置于提取溶剂乙腈或体积分数≥50％的乙腈-水混合溶液中涡旋振摇提取10-40min，其中，食品样品和提取溶剂的质量比为1:3～1:8，在4000～6000r/min条件下离心1-5min分层，获得提取液；b)原位衍生-液液分散微萃取：取一定体积提取液，依次加入萃取剂二氯甲烷和衍生试剂三氟乙酸，混匀后加入到水中，立即形成乳浊液，其中，所取提取液与水的体积比为1:3～1:8，将其置于30-50℃水浴中反应5-20min，提取液中的黄曲霉毒素被萃取到二氯甲烷中，同时被三氟乙酸衍生；反应结束后，有机相和水相分层，下层是有机相，上层是水相。其中，衍生试剂三氟乙酸与食品样品的质量比为1:2～4:2；c)将下层有机相转移至容器中，氮吹干复溶于乙腈/水溶剂中，获得上样溶液，直接用于液相色谱-荧光检测法检测黄曲霉毒素。实施例1花生中黄曲霉毒素B1的检测前处理方法一：本专利技术的前处理方法。具体步骤如下：a)样品提取：称取1g花生样品，均质化后置于4mL84％的乙腈/水提取溶剂中，涡旋振摇提取30min，6000r/min离心3min分层，获得提取液；b)原位衍生-液液分散微萃取：取0.8mL提取液，依次加入400μL萃取剂二氯甲烷和200μL衍生试剂三氟乙酸，混匀后加入到3.2mL水中，立即形成乳浊液体系，将其置于40℃水浴中反应10min；提取液中的黄曲霉毒素被萃取到二氯甲烷中，同时被三氟乙酸衍生；反应结束后，有机相和水相分层，下层为有机相，上层为水相；c)取下层有机相，氮吹干并复溶于80μL30％的乙腈/水溶剂中，获得上样溶液，直接用液相色谱-荧光检测法检测黄曲霉毒素；前处理方法二：文献方法(JSciFoodAgri2017；97；1805-1810)；检测方法：采用液相色谱-荧光检测法，仪器条件同文献(JSciFoodAgri2017；97；1805-1810)。检测结果：如表1表1对比两种前处理方法对于AFB1的检测限和定量限；结论：本专利技术的前处理方法对花生中黄曲霉毒素的检出限达到4ppt，其萃取-衍生效率是现有技术的10倍以上。实施例2玉米中的黄曲霉毒素的前处理a)样品提取：称取3份1g空白玉米，分别均质化，加标黄曲霉毒素B1的量分别为0.05、0.2、2ng/g，分别置于5mL84％的乙腈/水提取溶剂中，涡旋振摇提取20mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测食品基质中黄曲霉毒素的前处理方法，其特征在于：包括以下步骤：a)样品提取：称取均质化的食品样品置于提取溶剂中涡旋振摇提取，离心分层，获得提取液；b)原位衍生‑液液分散微萃取：取提取液，依次加入萃取剂二氯甲烷和衍生试剂三氟乙酸，混匀后加入到水中，体积比为1:100～100:1，形成乳浊液，将其置于水浴中反应；提取液中的黄曲霉毒素被萃取到二氯甲烷中，同时被三氟乙酸衍生；反应结束后，有机相和水相分层，下层是有机相，上层是水相；c)将下层有机相转移至容器中，氮吹干并复溶于乙腈/水溶剂中，获得上样溶液，所述上样溶液直接用于液相色谱‑荧光检测法检测黄曲霉毒素；所述步骤a)中提取溶剂为乙腈或乙腈‑水混合溶液，其中乙腈的体积分数≥50％；所述步骤b)中的提取液和水的体积比是1:2～1:10；衍生试剂三氟乙酸与步骤a)中的食品样品的质量比为1:1～5:2；萃取液中二氯甲烷与提取液的体积比为1:100～100:1；所述步骤c)中的复溶溶剂为乙腈‑水混合溶液，其中乙腈的体积分数为10％～30％。

【技术特征摘要】
1.一种检测食品基质中黄曲霉毒素的前处理方法，其特征在于：包括以下步骤：a)样品提取：称取均质化的食品样品置于提取溶剂中涡旋振摇提取，离心分层，获得提取液；b)原位衍生-液液分散微萃取：取提取液，依次加入萃取剂二氯甲烷和衍生试剂三氟乙酸，混匀后加入到水中，体积比为1:100～100:1，形成乳浊液，将其置于水浴中反应；提取液中的黄曲霉毒素被萃取到二氯甲烷中，同时被三氟乙酸衍生；反应结束后，有机相和水相分层，下层是有机相，上层是水相；c)将下层有机相转移至容器中，氮吹干并复溶于乙腈/水溶剂中，获得上样溶液，所述上样溶液直接用于液相色谱-荧光检测法检测黄曲霉毒素；所述步骤a)中提取溶剂为乙腈或乙腈-水混合溶液，其中乙腈的体积分数≥50％；所述步骤b)中的提取液和水的体积比是1:2～1:...

【专利技术属性】
技术研发人员：王楠，耿旭辉，关亚风，段春凤，邓婷，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21