基于光照调控的木糖母液微生物发酵维生素B12的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于光照调控的木糖母液微生物发酵维生素B12的方法，将利用维生素B12生产菌株的种子进行培养活化得到的维生素B12生产菌株扩培在SLB培养基中，将维生素B12生产菌株进行离心处理得到的生产维生素B12的沉淀菌株经过洗涤后接种在维生素B12检测培养基中，并在维生素B12检测培养基中使用了经过过滤冷灭菌方法预处理的木糖母液作为原料，在生产维生素B12的沉淀菌株发酵过程中，间歇性地对维生素B12检测培养基中发酵液实施光照处理，能够明显提高维生素B12生产菌株维生素B12的产量。本发明专利技术还具有操作简单、技术难度低等特点。

Microbial fermentation of vitamin B12 from xylose mother liquor based on light regulation

The present invention relates to a method of microbial fermentation of vitamin B12 in xylose mother liquor based on light control. The vitamin B12 producing strain obtained from the seed of vitamin B12 producing strain was cultured and activated in SLB medium, and the precipitating strain of vitamin B12 producing strain obtained by centrifugal treatment of vitamin B12 producing strain was washed and inoculated in vitamin B12 testing culture. The xylose mother liquor pretreated by filtration and cold sterilization was used as raw material in the medium for vitamin B12 detection. During the fermentation of precipitated strains producing vitamin B12, intermittent illumination treatment of the fermentation liquor in the medium for vitamin B12 detection could significantly increase the production of vitamin B12 by the strain producing vitamin B12. The invention also has the advantages of simple operation and low technical difficulty.

【技术实现步骤摘要】
基于光照调控的木糖母液微生物发酵维生素B12的方法
本专利技术微生物发酵
，特别涉及一种基于光照调控的木糖母液微生物发酵维生素B12的方法。
技术介绍
自然界中维生素B12只能由微生物合成，主要是细菌和放线菌，细菌以丙酸杆菌、脱氮假单胞菌为主，放线菌主要是链霉菌属。维生素B12早先是从抗生素废液中提取的，但是提取的效率低。化学合成又极其复杂，成本很高，关键是得到的产物纯度低，具有大量副产物，不适合产业化。目前工业化生产维生素B12主要使用微生物发酵法，因此一种提高产量对于发酵生产维生素B12具有重大意义。公布号CN102453690A的中国专利中公开了一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12高产菌株的诱变方法，通过诱变筛选的方法获取维生素B12高产菌株，该方法的主要缺点是诱变存在不确定性，且技术要求高。公告号CN108251476A的中国专利中公开了从酶制剂废水中提取维生素B12的方法，以酶制剂废水为原料，经过一系列处理后提取维生素B12，该方法主要的缺点是酶制剂废水需经过多道工序处理，相对比较复杂。YUEYU等人（YueYu、XuanZhu、etc，EnhancingthevitaminB12productionandgrowthofPropionibacteriumfreudenreichiiintofuwastewaterviaalight-inducedvitaminB12riboswitch，ApplMicrobiolBiotechnol，DOI10.1007/s00253-015-6958-6）已经研究发现，蓝光通过激发维生素B12核糖体开关可以提高豆腐废水发酵过程中维生素B12的产量，但是该研究发酵过程中在豆腐废水中添加了硫酸钴，而已有研究表明钴化合物能够增加维生素B12的合成。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种基于光照调控的木糖母液微生物发酵维生素B12的方法，提高维生素B12生产菌株在木糖母液培养基中维生素B12产量，操作简单、技术难度低，在不添加能够增加维生素B12产量物质的情况下，利用光照提高维生素B12的产量。本专利技术是这样实现的，提供一种基于光照调控的木糖母液微生物发酵维生素B12的方法，包括如下步骤：步骤一、将维生素B12生产菌株的种子进行培养活化，然后将活化后的维生素B12生产菌株接种5%至SLB培养基中扩培后置于4℃温度下待用；步骤二、采用过滤冷灭菌方法对木糖母液先进行预处理；步骤三、将步骤一中扩培得到的维生素B12生产菌株进行离心处理，弃上清液得到生产维生素B12的沉淀菌株，将该沉淀菌株进行洗涤；步骤四、将洗涤后的生产维生素B12的沉淀菌株接种至含有步骤二预处理后的木糖母液为培养基原料的维生素B12检测培养基中，与木糖母液一起进行发酵处理，同时将该维生素B12检测培养基静置于黑暗环境中65h~80h，而且，在距离维生素B12检测培养基10-50cm处设置光源，所述光源对维生素B12检测培养基进行间歇性照射，光源每次光照时间持续10min~80min，其光照时间与黑暗时间（非光照时间）的比例为1:2~5:1；步骤五、将步骤四发酵处理后的发酵溶液进行细胞破碎处理，再将细胞破碎处理后的发酵液进行低温离心处理，离心后得到含维生素B12的上清液，向该上清液中加入稀氰化钠溶液，再将处理后的上清液通过SPE柱萃取方式萃取维生素B12，收集萃取后含有维生素B12的洗脱液，用氮气吹干，洗脱液干燥后的产物即为维生素B12。进一步地，在步骤一中，所述维生素B12生产菌株的种子为费氏丙酸杆菌或谢氏丙酸杆菌，将维生素B12生产菌株的种子进行培养活化是指：将维生素B12生产菌株的种子从保藏管中接种1%至500mLMRS液体培养基中，置于培养箱中厌氧培养10h~14h，其中，所述MRS液体培养基的成分包括（g/L）：蛋白胨10.0，牛肉浸粉5.0，酵母浸粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，乙酸钠5.0，柠檬酸三铵2.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，吐温-801.0，pH为6.5±0.2。进一步地，在步骤一中，扩培方式是将维生素B12生产菌株置于SLB培养基中，在培养箱中静置培养2h~9h，使培养基中菌落形成单位达108CFU/mL，其中，SLB培养基成分包括（重量比）：1%胰蛋白胨，1%酵母提取物，1.5%葡萄糖，0.25‰K2HPO4，0.05‰MnSO4，0.1%吐温-80，调节pH6.5±0.2。进一步地，在步骤二中，所述过滤冷灭菌方法使用的工具包括：注射器、过滤器和0.22μm滤膜，过滤冷灭菌方法的操作步骤包括：将过滤器加上滤膜后盖紧，将组装好滤膜的过滤器与注射器旋紧，将待灭菌的木糖母液装入注射器中，然后缓慢推动注射器，使注射器里的木糖母液从过滤器中流过后灭菌，整个过程在无菌操作台上操作。进一步地，在步骤三中，离心处理的条件是在4℃、3000r/min下离心10min，洗涤该沉淀菌株的方式是用0.9%氯化钠溶液将沉淀菌株反复洗涤三遍。进一步地，在步骤四中，所述维生素B12检测培养基的成分包括（g/L）：酸水解酪蛋白12.0，核黄素0.002，吐温-802.0，磷酸氢二钾1.0，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁0.4，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.02，重量比1%的木糖母液，pH为6.3±0.2。进一步地，在步骤四中，所述光源为白炽灯，其功率为15-100W。进一步地，在步骤五中，所述细胞破碎处理是指使用细胞破碎仪对发酵溶液进行超声破碎，细胞破碎仪的工作功率为400W，工作时间3s，间歇时间3s，重复99次。进一步地，在步骤五中，所述低温离心处理是指将发酵液于4℃条件下离心8min，转速6000r/min。进一步地，在步骤五中，所述SPE柱萃取方式的步骤包括：用5mL90%的甲醇活化SPE柱子，再用15mL超纯水分三次洗涤甲醇，平衡柱子，处理后的上清液流过SPE柱后，先用5mL超纯水洗涤SPE柱吸附的杂质，再用真空泵抽干液体，然后用甲醇洗涤SPE柱，收集洗脱液留待后续处理。与现有技术相比，本专利技术的基于光照调控的木糖母液微生物发酵维生素B12的方法，将利用维生素B12生产菌株的种子进行培养活化得到的维生素B12生产菌株扩培在SLB培养基中，将维生素B12生产菌株进行离心处理得到的生产维生素B12的沉淀菌株经过洗涤后接种在维生素B12检测培养基中，并在维生素B12检测培养基中使用了经过过滤冷灭菌方法预处理的木糖母液作为原料，在生产维生素B12的沉淀菌株发酵过程中，间歇性地对维生素B12检测培养基中发酵液实施光照处理，能够明显提高维生素B12生产菌株维生素B12的产量。本专利技术还具有操作简单、技术难度低等特点。具体实施方式为了使本专利技术所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术基于光照调控的木糖母液微生物发酵维生素B12的方法的较佳实施例，包括如下步骤：步骤一、将维生素B12生产菌株的种子进行培养活化，然后将活化后的维生素B12生产菌株接种5%至SLB培养基中扩培后置于4℃温度下待用。步骤二、采用过滤冷灭菌方法对木糖母液先进行预处理。步骤三、将步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于光照调控的木糖母液微生物发酵维生素B12的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、将维生素B12生产菌株的种子进行培养活化，然后将活化后的维生素B12生产菌株接种5%至SLB培养基中扩培后置于4 ℃温度下待用；步骤二、采用过滤冷灭菌方法对木糖母液先进行预处理；步骤三、将步骤一中扩培得到的维生素B12生产菌株进行离心处理，弃上清液得到生产维生素B12的沉淀菌株，将该沉淀菌株进行洗涤；步骤四、将洗涤后的生产维生素B12的沉淀菌株接种至含有步骤二预处理后的木糖母液为培养基原料的维生素B12检测培养基中，与木糖母液一起进行发酵处理，同时将该维生素B12检测培养基静置于黑暗环境中65 h~80 h，而且，在距离维生素B12检测培养基10‑50 cm处设置光源，所述光源对维生素B12检测培养基进行间歇性照射，光源每次光照时间持续10 min~80 min，其光照时间与黑暗时间的比例为1:2~5:1；步骤五、将步骤四发酵处理后的发酵溶液进行细胞破碎处理，再将细胞破碎处理后的发酵液进行低温离心处理，离心后得到含维生素B12的上清液，向该上清液中加入稀氰化钠溶液，再将处理后的上清液通过SPE柱萃取方式萃取维生素B12，收集萃取后含有维生素B12的洗脱液，用氮气吹干，洗脱液干燥后的产物即为维生素B12。...

【技术特征摘要】
1.一种基于光照调控的木糖母液微生物发酵维生素B12的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、将维生素B12生产菌株的种子进行培养活化，然后将活化后的维生素B12生产菌株接种5%至SLB培养基中扩培后置于4℃温度下待用；步骤二、采用过滤冷灭菌方法对木糖母液先进行预处理；步骤三、将步骤一中扩培得到的维生素B12生产菌株进行离心处理，弃上清液得到生产维生素B12的沉淀菌株，将该沉淀菌株进行洗涤；步骤四、将洗涤后的生产维生素B12的沉淀菌株接种至含有步骤二预处理后的木糖母液为培养基原料的维生素B12检测培养基中，与木糖母液一起进行发酵处理，同时将该维生素B12检测培养基静置于黑暗环境中65h~80h，而且，在距离维生素B12检测培养基10-50cm处设置光源，所述光源对维生素B12检测培养基进行间歇性照射，光源每次光照时间持续10min~80min，其光照时间与黑暗时间的比例为1:2~5:1；步骤五、将步骤四发酵处理后的发酵溶液进行细胞破碎处理，再将细胞破碎处理后的发酵液进行低温离心处理，离心后得到含维生素B12的上清液，向该上清液中加入稀氰化钠溶液，再将处理后的上清液通过SPE柱萃取方式萃取维生素B12，收集萃取后含有维生素B12的洗脱液，用氮气吹干，洗脱液干燥后的产物即为维生素B12。2.如权利要求1所述的基于光照调控的木糖母液微生物发酵维生素B12的方法，其特征在于，在步骤一中，所述维生素B12生产菌株的种子为费氏丙酸杆菌或谢氏丙酸杆菌，将维生素B12生产菌株的种子进行培养活化是指：将维生素B12生产菌株的种子从保藏管中接种1%至500mLMRS液体培养基中，置于培养箱中厌氧培养10h~14h，其中，所述MRS液体培养基的成分包括（g/L）：蛋白胨10.0，牛肉浸粉5.0，酵母浸粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，乙酸钠5.0，柠檬酸三铵2.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，吐温-801.0，pH为6.5±0.2。3.如权利要求1所述的基于光照调控的木糖母液微生物发酵维生素B12的方法，其特征在于，在步骤一中，扩培方式是将维生素B12生产菌株置于SLB培养基中，在培养箱中静置培养2h~9h，使培养基中菌落形成单位达108CFU/mL，其中，SLB培养基成分包括（重量比）：1%胰蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：石丽华，朱炫，左齐乐，张文瑶，陈杰，陈跃文，郑晓阳，
申请(专利权)人：浙江华康药业股份有限公司，焦作市华康糖醇科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33