人呼吸道合胞病毒大规模培养的方法技术

本发明专利技术公开了一种人呼吸道合胞病毒大规模培养的方法，首先将长满单层的Hep‑2细胞使用胰酶消化液消化，然后将细胞悬液添加在细胞工厂进行细胞大规模扩增；待底部长满单层Hep‑2细胞后，将人呼吸道合胞病毒接种于细胞工厂，接种后第一天将培养基更换为无血清培养基进行培养，每天采用ELISA法检测上清中病毒效价，绘制病毒增殖曲线；培养至病毒效价达到最高值后，收取各瓶的病毒培养上清，同批次合并后，置2‑8℃备用。本发明专利技术方法中，在病毒接种后的第一天即将培养基更换为无血清培养基，极大的降低了收获病毒液中小牛血清的含量，减少了下游纯化的步骤，为人呼吸道合胞病毒疫苗的研制提供了保障。

Large-scale culture of human respiratory syncytial virus

The invention discloses a method for large-scale cultivation of human respiratory syncytial virus (HRSV). First, Hep_2 cells with single layer are digested with trypsin digestion solution, then cell suspension is added to the cell factory for large-scale cell expansion; after the bottom minister is full of single Hep_2 cells, HRSV is inoculated in the cell factory, and the culture medium is replaced by none on the first day after inoculation. Serum culture medium was used to detect the viral titer in supernatant by ELISA every day, and the virus proliferation curve was drawn. After the viral titer reached the highest value, each bottle of viral culture supernatant was collected and merged in the same batch and stored at 2 8 C for reserve. In the method, the culture medium is replaced with serum-free culture medium on the first day after virus inoculation, which greatly reduces the content of calf serum in the harvested virus solution, reduces the downstream purification steps, and provides guarantee for the development of human respiratory syncytial virus vaccine.

【技术实现步骤摘要】
人呼吸道合胞病毒大规模培养的方法
本专利技术涉及病毒的培养，尤其是涉及一种人呼吸道合胞病毒大规模培养的方法。
技术介绍
人呼吸道合胞病毒(RSV)，属副粘液病毒科，该病毒经空气飞沫和密切接触传播，多见于新生儿和6个月以内的婴儿，潜伏期3~7日。婴幼儿症状较重，表现有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为细支气管炎及肺炎；少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后，主要表现为上呼吸道感染。确诊可分离病毒及做血清补体结合试验和中和试验。应用免疫荧光技术检查鼻咽分泌物中病毒抗原，可作快速诊断。治疗以支持和对症疗法为主，有继发细菌感染时，可用抗菌药治疗。RSV在电镜下所见与副流感病毒类似，病毒颗粒大小约为150nm，较副流感病毒稍小，为RNA病毒，对乙醚敏感，无血球凝集性，在人上皮组织培养形成特有的合胞，病毒在胞浆内增殖，可见胞浆内包涵体。截止目前，对于人类呼吸道合胞病毒引起的呼吸道感染还没有特效药物，也没有制造出疫苗。而制造疫苗，首先就需要大规模培养人类呼吸道合胞病毒。传统培养人类呼吸道合胞病毒的方法是：细胞通过玻璃滚瓶经逐级传代扩增，病毒接种后，经3~7天培养，然后再进行病毒悬液收获。由于接种病毒用培养基中含有2%小牛血清，后期纯化存在较大困难，如果将其用于制备疫苗，则增加牛血清残留超过国家标准的风险；同时使用玻璃滚瓶生产人类呼吸道合胞病毒，需要的瓶子数量多、操作复杂、人工成本高，严重影响了对人类呼吸道合胞病毒疫苗的进一步研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种操作简单，能对人呼吸道合胞病毒进行大规模培养的方法，以满足对人类呼吸道合胞病毒疫苗的研究和制造需求。为实现上述目的，本专利技术可采取下述技术方案：本专利技术所述的人呼吸道合胞病毒大规模培养的方法，包括下述具体步骤：第一步，将培养瓶中长满单层的Hep-2细胞使用胰酶消化液消化细胞，然后按1:3-4进行细胞的传代扩增，于37℃、5%CO2条件下培养；第二步，使用细胞工厂，将第一步消化后得到的细胞悬液按200ml/层添加量，进行细胞大规模扩增；第三步，将人呼吸道合胞病毒按0.01~0.1MOI接种于细胞工厂底部长满单层的Hep-2细胞上，使用含有2%小牛血清的DMEM培养基，于34±1℃、5%CO2条件下培养；第四步，接种后的第一天进行换液，将培养基更换为无血清培养基，然后于34±1℃、5%CO2条件下培养；培养过程中，每天采用ELISA法检测上清中病毒效价，绘制病毒增殖曲线；第五步，培养至病毒效价达到最高值（ELISA法检测吸光值不低于3.5）后，收取各瓶的病毒培养上清，同批次合并后，置2-8℃备用。所述第四步换液后所用的无血清培养基是在DMEM培养基中添加1%的血清替代物（如Sigma的ITSE）制备而成。本专利技术的优点在于病毒接种后的第一天即进行换液，将培养基更换为改良后的无血清培养基，极大的降低了收获病毒液中小牛血清的含量，减少了下游纯化的步骤，为人呼吸道合胞病毒疫苗中牛血清残留符合国家标准提供了保障。具体实施方式下面通过具体实例，对本专利技术方法作更加详细的说明,以便于本领域技术人员对本申请的理解。本专利技术所用的试剂和仪器均为本领域常规产品，所用检测方法也为本领域常规方法。本专利技术所述的人呼吸道合胞病毒大规模培养的方法，包括下述具体步骤：第一步，选用125cm2方瓶，将Hep-2细胞按1:3-4的比例接种于培养瓶中（一般为50ml/瓶），待培养瓶中Hep-2细胞长满单层后，使用胰酶消化液消化细胞，待细胞成毛玻璃状后，加入含小牛血清的培养基，终止消化，悬起细胞；然后按1:3-4的比例进行细胞的传代扩增，将培养瓶放入培养箱内37℃、5%CO2条件下培养3天；第二步，按照第一步的方法，选择10层细胞工厂（实际使用时，可根据所需规模进行调整）进行细胞大规模扩增，每层加入200ml含有10%小牛血清的DMEM培养基；第三步，待大规模扩增的细胞长满单层后，将人呼吸道合胞病毒于37℃快速融化，按0.05MOI计算病毒接种量，将所需体积的毒种接种于Hep-2细胞上，并补加含有2%小牛血清的DMEM培养基200ml至每层细胞工厂，于34±1℃、5%CO2培养；第四步，接种后第一天进行换液，将原含有2%小牛血清的DMEM培养基更换为改良后的无血清培养基（含有1%血清替代物ITSE的DMEM）；第五步，接下来每天无菌抽取培养上清，采用ELISA夹心法检测上清中病毒效价，绘制病毒增殖曲线，见下表1；接毒后第6天进行病毒效价检测，酶免吸光值达到6.39，收取各瓶的病毒培养上清，同批次合并后的病毒培养液置于2-8℃保存备用。经检测，病毒培养液中的牛血清残留量为39.6ng/ml，满足国家标准（不高于50ng/ml）的规定。本专利技术方法操作简单，可对人呼吸道合胞病毒进行大规模培养，制备出高效价的病毒培养物，满足了对人类呼吸道合胞病毒疫苗的进一步研究。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人呼吸道合胞病毒大规模培养的方法，其特征在于：包括下述具体步骤：第一步，将培养瓶中长满单层的Hep‑2细胞使用胰酶消化液消化细胞，然后按1:3‑4进行细胞的传代扩增，于37℃、5%CO2条件下培养；第二步，使用细胞工厂，将第一步消化后得到的细胞悬液按200ml/层添加量，进行细胞大规模扩增；第三步，将人呼吸道合胞病毒按0.01~0.1MOI接种于细胞工厂底部长满单层的Hep‑2细胞上，使用含有2%小牛血清的DMEM培养基，于34±1℃、5%CO2条件下培养；第四步，接种后的第一天进行换液，将培养基更换为无血清培养基，然后于34±1℃、5%CO2条件下培养；培养过程中，每天采用ELISA法检测上清中病毒效价，绘制病毒增殖曲线；第五步，培养至病毒效价达到最高值后，收取各瓶的病毒培养上清，同批次合并后，置2‑8℃备用。

【技术特征摘要】
1.一种人呼吸道合胞病毒大规模培养的方法，其特征在于：包括下述具体步骤：第一步，将培养瓶中长满单层的Hep-2细胞使用胰酶消化液消化细胞，然后按1:3-4进行细胞的传代扩增，于37℃、5%CO2条件下培养；第二步，使用细胞工厂，将第一步消化后得到的细胞悬液按200ml/层添加量，进行细胞大规模扩增；第三步，将人呼吸道合胞病毒按0.01~0.1MOI接种于细胞工厂底部长满单层的Hep-2细胞上，使用含有2%小牛血清的DMEM培养基，于34±...

【专利技术属性】
技术研发人员：周伟伟，李桂林，赵巧辉，石海亮，周雷鸣，孙静静，陈超，付光宇，吴学炜，杨增利，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41