一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法技术

本发明专利技术公开了一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法。本发明专利技术具有如下步骤：(1)交联透明质酸钠凝胶用含底物荧光素的透析液透析溶胀；(2)将溶胀完成的交联透明质酸钠凝胶制成凝胶颗粒；(3)凝胶颗粒，用预灌封注射器灌装、灭菌，得到交联透明质酸钠凝胶注射剂，注射于动物体皮下部位；(4)将可持续表达荧光蛋白的细胞注射至动物体腹腔部位，通过活体成像仪器观察出现荧光的细胞情况，从而评价注射的交联透明质酸钠凝胶在体内的降解周期。本发明专利技术具有数据真实准确、方法科学可行等优点。

A method for evaluating the degradation cycle of medical crosslinked sodium hyaluronate gel in vivo

The invention discloses a method for evaluating the degradation cycle of medical crosslinked sodium hyaluronate gel in vivo. The invention has the following steps: (1) crosslinked sodium hyaluronate gel is dialysated by dialysate containing substrate fluorescein; (2) the crosslinked sodium hyaluronate gel prepared by swelling is made into gel particles; (3) gel particles are filled and sterilized by pre filling syringe, and then the injection of sodium hyaluronate gel is injected into the subcutaneous part of the animal body; (4) the fluorescent protein is continuously expressed. The cells were injected into the abdominal cavity of the moving object, and the fluorescent cells were observed by living imaging apparatus, and the degradation cycle of the crosslinked sodium hyaluronate gel was evaluated. The invention has the advantages of true and accurate data, scientific and feasible method, etc.

【技术实现步骤摘要】
一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法
本专利技术属于生物降解
，特别是涉及一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法。
技术介绍
透明质酸类产品是目前最流行的可吸收皮肤填充剂，作为一种生理活性物质，广泛分布在动物和人体结缔组织细胞外基质中。他在溶液中无规则转曲状态和它的流体动力学特性，赋予其某些重要的物理特性如高粘弹性，可塑性，独特的流变学特性以及良好的生物相容性。正因为如此，它是一种用途广泛的可吸收生物材料。随着科技发展，玻璃酸钠的交联技术也日益提高，通过交联可获得不同分子量大小和不同结构的交联玻璃酸钠，他们的性状如粘弹性，降解时间等也各不相同，根据这些特性，适应症和具体用途也各不相同。在新产品开发过程中，一般是通过体外酶解的方式来评价透明质酸的交联度，从而间接反映该产品的降解周期，推断临床应用上的维持时间，但这种方法受到诸多因素影响，如体外酶解实验凝胶颗粒的分散状态和实际临床应用中凝胶颗粒的状态、模拟酶解条件中酶浓度和人体类实际酶浓度等都会影响最终结果的判断，且两种方法之间的关联性无法得到很好的认证。另外一种是采用动物皮下植入的方式，传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据，得到多个时间点的实验结果，动物的个体差异以及目视法评估的方法(尤其是降解后期)均对实验结果的判断存在一定的影响。为了解决现有技术存在的问题，本专利技术开发了一种利用活体动物体内可见光成型技术原理，评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，该方法采用体内可见光成像技术通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)，所得的数据也更科学、真实可信，为评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期提供了更为科学的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法。本专利技术具有数据真实准确、方法科学可行的优点。为了达到上述的目的，本专利技术采取以下技术方案：一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，具有如下步骤：(1)透析与溶胀：交联透明质酸钠凝胶用含底物荧光素的透析液透析，直至凝胶溶胀至所需重量；(2)制粒：将溶胀完成的交联透明质酸钠凝胶，用筛网进行制粒得到所需粒径的交联透明质酸钠凝胶颗粒；(3)灌装灭菌：将步骤(2)制备得到的交联透明质酸钠凝胶颗粒，用预灌封注射器灌装、灭菌，得到交联透明质酸钠凝胶注射剂，注射于动物体皮下部位；(4)将可持续表达荧光蛋白的细胞注射至动物体腹腔部位，通过活体成像仪器观察出现荧光的细胞情况，从而评价注射的交联透明质酸钠凝胶在体内的降解周期。在本专利技术的一个优选实施中，所述步骤(1)中，所述交联透明质酸钠凝胶通过如下方法制备：透明质酸钠原料用含有交联剂的氢氧化钠溶液完全溶解得到透明质酸钠凝胶，溶解完成后将凝胶制备成一定厚度的块状，在水浴内加热保温，进行交联反应。在本专利技术的一个优选实施中，所述透明质酸钠原料为发酵法或鸡冠提取法制备。在本专利技术的一个优选实施中，所述氢氧化钠溶液的质量浓度为0.5-3.5％。在本专利技术的一个优选实施中，溶解完成后的透明质酸钠质量浓度为12-24％。在本专利技术的一个优选实施中，所述交联剂与透明质酸钠原料的质量比为1:5-1:30。在本专利技术的一个优选实施中，所述交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、聚乙二醇、京尼平、碳化二亚胺中的一种或任意两种以上的混合。在本专利技术的一个优选实施中，所述水浴温度为20℃-60℃。在本专利技术的一个优选实施中，所述交联反应时间为1h-4h。在本专利技术的一个优选实施中，所述步骤(1)中，所述透析液为氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和底物荧光素组成的生理平衡液。在本专利技术的一个优选实施中，所述步骤(1)中，所述透析液所用的量为凝胶重量的10-50倍。在本专利技术的一个优选实施中，所述步骤(1)中，透析过程中根据透析结果更换透析液的次数为2-6次。在本专利技术的一个优选实施中，所述步骤(1)中，透析终点的控制为溶胀后的块状凝胶为溶胀前的块状凝胶重量的40-90倍。在本专利技术的一个优选实施中，所述步骤(2)中，所述交联透明质酸钠凝胶颗粒的粒径为150-600μm。在本专利技术的一个优选实施中，所述步骤(4)中，可持续表达荧光蛋白的细胞通过如下方法制备：(4.1)质粒制备：将发光酶基因操纵子luxABCDE克隆进包含腺病毒末端重复序列的载体质粒pAOV.SYN.GFP，获得足够量的重组AAV表达质粒DNA；(4.2)将液氮冻存的AAV293系细胞在37℃水浴中复苏，在完全培养基中进行培养，过程换液2-3次，汇合率达到50％用培养皿进行传代，，倒置显微镜观察细胞汇合率达到60-70％，即得到病毒包装用细胞；(4.3)将步骤(4.1)得到的重组AAV表达质粒DNA，用pH7.5TE缓冲液将质粒的浓度调整到1mg/ml后，连同包装质粒和辅助质粒吸取各12ul，与1ml浓度为0.3mol/L的CaCl2溶液混合，振匀备用；(4.4)吸取1ml的2XHBS与0.8ml前一步骤得到的的DNA/CaCl2混合，观察产生的白色沉淀大小，如未出现明显的絮状沉淀，将混合液液缓慢滴加至细胞培养皿内，同时轻轻晃动，使得尽量均匀分散，在5％CO2培养箱，37℃条件下培养6h后更换新鲜的完全培养基，过程换液2-3次，约60h后观察出毒效果，倒置显微镜下观察绿色荧光达到70-90％覆盖面时病毒包装完成；(4.5)弃去细胞培养皿上清液，用胰酶-EDTA溶液消化细胞2-3min后，反复吹打使贴壁细胞从培养皿上脱落，收集细胞后，在液氮中反复冻融三次使细胞破碎，离心，收集病毒上清液备用；(4.6)配制4中不同浓度的碘克沙醇溶液，在高速冷冻离心管内制备密度梯度离心体系，从下到上分别为浓度依次升高的碘克沙醇溶液，最上一层为病毒上清液，高速冷冻离心，收集富集的病毒颗粒，用PBS缓冲液分散病毒颗粒后，再离心超滤，去除残留的碘克沙醇，最终得到0.5ml含发光酶基因的AAV病毒浓缩液；(4.7)将含发光酶基因的AAV病毒感染293T细胞，培养4h后，加入浓度为150mg/ml的底物荧光素0.1ml培养20min，得到可持续表达荧光蛋白的细胞。在本专利技术的一个优选实施中，所述步骤(4.6)中，密度梯度离心体系中碘克沙醇溶液的浓度为10％、20％、30％、40％、50％、60％中的任意四种组合。在本专利技术的一个优选实施中，所述步骤(4.6)中，收集富集病毒颗粒的浓度区间为40％、50％、60％中的任意两种组合。在本专利技术的一个优选实施中，所述步骤(4.6)中，密度梯度所使用离心力为50000至150000g。在本专利技术的一个优选实施中，所述步骤(4.6)中，去除残留的碘克沙醇所用到超滤管内超滤膜分子量的范围为5000-100000道尔顿。在本专利技术的一个优选实施中，所述步骤(4.7)中，加入底物荧光素的浓度为30-150mg/ml。活体动物体内可见光成像技术的原理是：将荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时，荧光素酶也会得到持续稳定的表达。将标记好的细胞接种到实验动物体内后，当外源(腹腔或静脉注射)给予其底物荧光素，即可在几分钟内产生发光现象。这本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，具有如下步骤：(1)透析与溶胀：交联透明质酸钠凝胶用含底物荧光素的透析液透析，直至凝胶溶胀至所需重量；(2)制粒：将溶胀完成的交联透明质酸钠凝胶，用筛网进行制粒得到所需粒径的交联透明质酸钠凝胶颗粒；(3)灌装灭菌：将步骤(2)制备得到的交联透明质酸钠凝胶颗粒，用预灌封注射器灌装、灭菌，得到交联透明质酸钠凝胶注射剂，注射于动物体皮下部位；(4)将可持续表达荧光蛋白的细胞注射至动物体腹腔部位，通过活体成像仪器观察出现荧光的细胞情况，从而评价注射的交联透明质酸钠凝胶在体内的降解周期。

【技术特征摘要】
1.一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，具有如下步骤：(1)透析与溶胀：交联透明质酸钠凝胶用含底物荧光素的透析液透析，直至凝胶溶胀至所需重量；(2)制粒：将溶胀完成的交联透明质酸钠凝胶，用筛网进行制粒得到所需粒径的交联透明质酸钠凝胶颗粒；(3)灌装灭菌：将步骤(2)制备得到的交联透明质酸钠凝胶颗粒，用预灌封注射器灌装、灭菌，得到交联透明质酸钠凝胶注射剂，注射于动物体皮下部位；(4)将可持续表达荧光蛋白的细胞注射至动物体腹腔部位，通过活体成像仪器观察出现荧光的细胞情况，从而评价注射的交联透明质酸钠凝胶在体内的降解周期。2.根据权利要求1所述的一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，交联透明质酸钠凝胶通过如下方法制备：透明质酸钠原料用含有交联剂的氢氧化钠溶液完全溶解得到透明质酸钠凝胶，溶解完成后将凝胶制备成一定厚度的块状，在水浴内加热保温，进行交联反应。3.根据权利要求2所述的一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，所述氢氧化钠溶液的质量浓度为0.5-3.5％；溶解完成后的透明质酸钠质量浓度为12-24％；所述交联剂与透明质酸钠原料的质量比为1:5-1:30；所述水浴温度为20℃-60℃，交联反应时间为1h-4h。4.根据权利要求2所述的一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，所述交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、聚乙二醇、京尼平、碳化二亚胺中的一种或任意两种以上的混合。5.根据权利要求2所述的一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述透析液为氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和底物荧光素组成的生理平衡液。6.根据权利要求1所述的一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，透析终点的控制为溶胀后的块状凝胶为溶胀前的块状凝胶重量的40-90倍。7.根据权利要求1所述的一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述交联透明质酸钠凝胶颗粒的粒径为150-600μm。8.根据权利要求1所述的一种评价医用交联透明质酸钠凝胶在体内降解周期的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，可持续表达荧光蛋白的细...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈亮，
申请(专利权)人：浙江景嘉医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33