一种组织工程化心肌补片及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种组织工程化心肌补片，其特征在于此心肌补片由多种天然高分子材料制备的基底膜以及基底膜上的多层细胞所构成，具有与心肌组织相似的组成、结构及功能。本发明专利技术还提供上述组织工程化心肌补片的制备方法。本发明专利技术操作简单，成本低，所制备的组织工程化心肌补片生物活性高，强度好，可贴附在心脏受损部位，促进受损心肌组织的修复。本发明专利技术克服了已有技术的缺陷，在再生医学领域中将发挥重要作用。

A tissue-engineered myocardial patch and its preparation and Application

The invention relates to a tissue-engineered myocardial patch, which is characterized in that the myocardial patch is composed of a basement membrane prepared by a variety of natural macromolecule materials and multilayer cells on the basement membrane, and has similar composition, structure and function with the myocardial tissue. The invention also provides a preparation method of the tissue engineered myocardial patch. The method has the advantages of simple operation, low cost, high bioactivity and good strength, and can be attached to the damaged part of the heart to promote the repair of damaged myocardial tissue. The invention overcomes the defects of the prior technology and will play an important role in the field of regenerative medicine.

【技术实现步骤摘要】
一种组织工程化心肌补片及其制备和应用
本专利技术涉及再生医学领域，特别涉及一种组织工程化心肌补片及其制备和应用。
技术介绍
现有的溶栓药物与介入手术疗法尽管可以改善心肌梗死患者的症状，但却无法逆转坏死心肌。对于严重的心肌梗死患者，器官移植是根本治疗手段，但由于移植供体的缺乏与免疫排斥问题，严重限制了器官移植的开展。尽管一些临床研究证实常规细胞注射方法能够改善患者心功能，但是存在细胞存留量少、细胞活率低以及心律失常等问题。心肌补片是通过组织工程手段制备的片状的工程化心脏组织，它具有细胞片层结构，能够提高植入后细胞的存留量和存活率，因此越来越受到重视。不同的构建方法可以制备不同特点的心肌补片，其功能和特性也各不相同，对治疗效果有很大影响。目前研究比较广泛的是日本TeruoOkano团队专利技术的无载体细胞片层制备方法，即利用温敏材料聚异丙基丙烯酰胺在37℃呈疏水性，在20℃时材料转变为亲水性这一原理，将温敏材料铺在培养皿底部并在其上种植种子细胞，细胞经一段时间培养并建立好细胞间连接后，通过降低温度(20℃)使得细胞片逐渐与培养皿底部分离。然而他们所制备的细胞片层是依靠细胞之间的连接构成的，培养时间长，且细胞层厚度受限，力学强度低，因此移植前的培养时间较长，移植时细胞片层缺乏支撑，操作困难。与无载体细胞片层相比，有载体细胞片层是使用支架材料作为补片的基底层，一方面可显著提高细胞片层的厚度和力学强度，增加移植手术的可操作性，另一方面支架材料的特性可以影响心肌组织微环境及细胞片层的活性和功能。目前心肌补片基底层主要包括聚丙烯晴、聚己内酯等人造高分子基底层，以及胶原、壳聚糖、蚕丝蛋白等一种或两种天然高分子所构建的基底层，其成分、结构及功能与体内细胞外基质差距很大，缺乏足够的生物活性。另外，目前复合有单细胞层的心肌补片已经得到了应用，取得了广泛认可，但是单细胞层尚未形成微组织，缺乏足够的生物学功能，治疗效果还是很有限。为了改善现有心肌补片基底层与体内细胞外基质相差较大以及单细胞层生物功能受限的问题，本专利技术提出了一种新型的组织工程化心肌补片及其制备方法。本专利技术提出的心肌补片由仿细胞外基质的基底膜以及基底膜上的多层细胞构成，是与体内心肌组织更加相似的微型心肌组织，具有更高的生物学活性和更好的力学强度，且植入操作更方便，能够显著提高治疗效果。因此，本专利技术克服了已有技术的缺陷，在心肌修复领域中将发挥重要作用。
技术实现思路
本专利技术公开了一种组织工程化心肌补片，此心肌补片由多种天然高分子材料制备的基底膜以及基底膜上的多层细胞所构成；所述天然高分子材料为分子量为5000-300000kDa的壳聚糖、分子量为1000000-4000000kDa的透明质酸或胶冻强度为大于100Bloomg的明胶中的一种或两种以上，所述多层细胞为心肌细胞、成肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞的一种或两种以上，所述细胞包括干细胞向心肌细胞诱导分化获得的细胞。此心肌补片由多种天然高分子材料制备的基底膜以及基底膜上的多层细胞所构成，具有与心肌组织相似的组成、结构及功能。本专利技术的组织工程化心肌补片通过以下具体技术方案予以制备：(1)制备含有壳聚糖、透明质酸及明胶的成胶水溶液，之后加入交联剂进行交联反应，获得凝胶膜，再经过中和、清洗及干燥后即得到基底膜；(2)在基底膜上接种细胞并培养，形成第一层细胞层；(3)在第一层细胞层之上加入细胞粘附剂，之后接种细胞并培养，形成第二层细胞层；(4)在第二层细胞层上再加入细胞粘附剂，接种细胞并培养，形成第三层细胞层；(5)以此类推，可制备具有1-10层细胞层的心肌补片。所述壳聚糖的分子量为5000-300000kDa，其在成胶水溶液中的浓度为1-10％(w/v,g/ml)；所述透明质酸的分子量为1000000-4000000kDa，其在成胶水溶液中的浓度为0.1-1％(w/v,g/ml)；所述明胶包括碱性明胶、酸性明胶的一种或两种混合；所述明胶的胶冻强度为大于100Bloomg，优选胶冻强度为120～200Bloomg，其在成胶水溶液中的浓度为3-15％(w/v，g/ml)。所述交联剂为甲醛、戊二醛、京尼平或碳二亚胺的一种或两种以上；所述交联剂与成胶水溶液混合后的交联剂浓度为0.01-3％(w/v,g/ml)。所述交联条件为温度18-25℃，湿度50-80％。所述中和过程为使用浓度0.03～0.5M，优选浓度0.1M的甘氨酸溶液浸泡交联形成的凝胶膜，浸泡时间为：1～4h。所述干燥的条件为温度18-25℃，湿度20％。所述基底膜包括壳聚糖、透明质酸、明胶及交联剂，其各自质量百分比为2.2-62.1％(w/w)、0.2-6.2％(w/w)、6.6-93％(w/w)及0.02-18.6％(w/w)。所述细胞包括心肌细胞、成肌细胞、内皮细胞或成纤维细胞的一种或两种以上；所述细胞包括干细胞向心肌细胞诱导分化获得的细胞。所述细胞粘附剂包括纤维蛋白、胶原、多聚赖氨酸、壳聚糖衍生物或Matrigel中的一种或两种以上；所述细胞粘附剂的浓度为纤维蛋白1-3％(w/v,g/ml)、胶原3-8％(w/v,g/ml)、多聚赖氨酸1-4％(w/v,g/ml)、壳聚糖衍生物1-3％(w/v,g/ml)、Matrigel3-10％(w/v,g/ml)。所述接种并培养细胞层之间间隔时间为1～3天。一种组织工程化心肌补片贴附于受损心肌组织表面修复心肌损伤的应用。本专利技术的优点1.体内细胞外基质由蛋白、多糖等活性物质构成，本专利技术利用多种天然高分子材料制备了与体内细胞外基质组成及结构相近的仿生基底膜，显著提高了基底膜的生物活性，为细胞层提供了更好的生长微环境，并有利于与宿主心肌组织的融合，同时还显著提高了补片的力学强度和韧性，有利于植入操作；2.本专利技术在仿生基底膜上利用层层组装技术制备了多层细胞层，使得补片形成了功能性心肌微组织，其生物活性比常规单细胞层更高，体内促心肌修复效果更好。具体实施方式实施例1：制备含有1％(w/v,g/ml)壳聚糖(5000kDa)、1％(w/v,g/ml)透明质酸(4000000kDa)及3％(w/v,g/ml)酸性明胶(120Bloomg)的成胶水溶液10g，之后加入交联剂戊二醛进行交联反应，交联剂终浓度为0.01％(w/v,g/ml)，交联条件为温度23℃，湿度60％，获得凝胶膜，再经过0.1M甘氨酸溶液中和(浸泡时间为1h)、清洗及干燥(18℃，湿度20％。)后即得到仿细胞外基质基底膜。之后，在此基底膜上接种大鼠心肌细胞和血管内皮细胞(两种类型细胞的数量比例为2∶1)并培养2天，形成第一层细胞层。在此第一层细胞层之上加入细胞粘附剂4％(w/v,g/ml)的多聚赖氨酸溶液(200微升/cm2)，之后接种上述同样的细胞悬液并培养2天，形成第二层细胞层。在第二层细胞层上再加入细胞粘附剂3％(w/v,g/ml)胶原溶液(200微升/cm2)，再接种同样的细胞悬液并培养2天，从而制备了具有三层细胞层结构的组织工程化心肌补片。此外，制备只具有一层细胞的心肌补片以及没有细胞层的心肌补片作为实验对照组，制备过程除了细胞层数不同，其余步骤同上所述。将上述三种心肌补片以及具有一层细胞的聚丙烯晴心肌补片植入大鼠心肌梗死模型受损心肌组织部位的表面，4周后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组织工程化心肌补片，其特征在于：此心肌补片由多种天然高分子材料制备的基底膜以及基底膜上的多层细胞所构成；所述天然高分子材料为分子量为5000‑300000kDa的壳聚糖、分子量为1000000‑4000000kDa的透明质酸或胶冻强度为大于100Bloom g的明胶中的一种或两种以上，所述多层细胞为心肌细胞、成肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞的一种或两种以上，所述细胞包括干细胞向心肌细胞诱导分化获得的细胞。

【技术特征摘要】
1.一种组织工程化心肌补片，其特征在于：此心肌补片由多种天然高分子材料制备的基底膜以及基底膜上的多层细胞所构成；所述天然高分子材料为分子量为5000-300000kDa的壳聚糖、分子量为1000000-4000000kDa的透明质酸或胶冻强度为大于100Bloomg的明胶中的一种或两种以上，所述多层细胞为心肌细胞、成肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞的一种或两种以上，所述细胞包括干细胞向心肌细胞诱导分化获得的细胞。2.根据上述权利要求所述的一种组织工程化心肌补片的制备方法，其制备步骤为：(1)制备含有壳聚糖、透明质酸或明胶中一种或两种以上的成胶水溶液，之后加入交联剂进行交联反应，获得凝胶膜，再经过中和、清洗及干燥后即得到基底膜；(2)在基底膜上接种细胞并培养，形成第一层细胞层；(3)在第一层细胞层之上加入细胞粘附剂，之后接种细胞并培养，形成第二层细胞层；(4)在第二层细胞层上再加入细胞粘附剂，接种细胞并培养，形成第三层细胞层；(5)以此类推重复制备细胞层，可制备具有1-10层细胞层的心肌补片。3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述壳聚糖的分子量为5000-300000kDa，其在成胶水溶液中的浓度为1-10％(w/v,g/ml)；所述透明质酸的分子量为1000000-4000000kDa，其在成胶水溶液中的浓度为0.1-1％(w/v,g/ml)；所述明胶包括碱性明胶、酸性明胶的一种或两种混合；所述明胶的胶冻强度为大于100Bloomg，优选胶冻强度为120～200Bloomg，其在成胶水溶液中的浓度为3-...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙广炜，刘洋，张英，赵姗，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21