用于检测癌症放疗敏感性的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及用于检测癌症放疗敏感性的试剂盒及其在疗效预测上的应用，本发明专利技术对分子标志物的筛选完全是基于国际研究水平中较为实用和有效的筛选方式——全基因组RNAi文库筛选。鉴定是在体内外基于放疗耐受诱导过程中逐级进行，最终发现RFC4是一个与结直肠癌放疗耐受极为相关的基因。并且，对筛选鉴定出的RFC4基因进行临床回顾性研究分析和体内外功能分析，均发现较高的表达水平能够与肿瘤退缩不良存在正相关性，可以用以预测放疗耐受/敏感程度。基于上述发现，获得一种用于预测局部进展期新辅助放疗疗效的试剂盒，其对于解决个体间临床疗效差异与退缩效果/预后效果预测空白的难题，更好地实现精准治疗具有非常重要的现实意义。

A Kit for Detecting Radiotherapy Sensitivity of Cancer and Its Application

The present invention relates to a kit for detecting radiosensitivity of cancer and its application in therapeutic effect prediction. The screening of molecular markers is based on the screening of genome-wide RNAi libraries, which is a practical and effective screening method at the international research level. The identification was carried out step by step during induction of radiotherapy tolerance in vivo and in vitro, and RFC4 was found to be a gene closely related to radiotherapy tolerance in colorectal cancer. In addition, clinical retrospective analysis and in vivo and in vitro functional analysis of the screened RFC4 gene showed that higher expression levels were positively correlated with poor tumor regression, which could be used to predict radiotherapy tolerance/sensitivity. Based on the above findings, a kit for predicting the efficacy of locally advanced neoadjuvant radiotherapy is obtained. It is of great practical significance to solve the problem of the gap between clinical efficacy and regression/prognosis prediction, and to better achieve precise treatment.

【技术实现步骤摘要】
用于检测癌症放疗敏感性的试剂盒及其应用
本专利技术属于分子诊断领域，涉及一种能够预测局部进展期直肠癌放疗疗效的方法，具体涉及一种基于结直肠癌放疗耐受基因RFC4而开发得到的应用于治疗前预测放疗敏感性的组合物。
技术介绍
近年来我国直肠癌发病率逐年上升，严重威胁人民健康。尤其是中低位局部进展期直肠癌，手术切除难度较大，局部复发风险高，预后较差。目前国内外指南均推荐新辅助放化疗联合手术切除为局部进展期直肠癌的标准治疗模式。新辅助放化疗能提高肿瘤的局部控制率、手术切除率及保肛率，降低复发率，然而，新辅助治疗给患者带来治疗益处的同时也增加了其治疗的毒副作用，获益人群占比较少，仍有较多问题亟待解决。尤其在放疗领域：个体间临床疗效差异较大，即使接受同等方案及剂量的新辅助放疗仍有约半数肿瘤未获得明显退缩，甚至存在进展的情况；缺乏退缩效果及预后效果预测、毒理评价体系。回答好以上问题，就能更好地实现精准治疗，因此，开发新的肿瘤分子标志物用于局部进展期新辅助放疗疗效的预测具有重要意义。目前已经发现的与直肠癌放化疗敏感性相关的标志物主要集中于p53、EGFR、TS、Ki-67、p21及Bcl-2/Bax等的研究，EGFR、TS表达高低及SNP多态性可能是目前最有价值的预测术前放化疗效果的标志物之一。令人遗憾的是，尽管大量研究发现一些可能具有潜在预测价值的分子标志，但迄今为止还没有发现真正用于临床辅助诊断、预测直肠癌新辅助放化疗疗效的分子，尤其是专门针对放疗疗效的标志物。目前，在临床上欠缺关键的肿瘤分子标志物用于检测局部进展期直肠癌放疗的敏感性，暂时没有相应的试剂盒用于检测。专利
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，专利技术人经过长期研究发现，RFC4是复制因子C(RFC)5个亚基的成员之一，在机制上专利技术人发现它能够正向促进非同源末端链接的DNA双链断裂损伤修复。因此，RFC4的异常表达能够指示放疗耐受情况，能够应用于诊断预测。本专利技术的目的在于提供一种试剂盒，所述试剂盒能够特异性地检测RFC4基因的表达水平高低，作为判断放疗敏感/耐受的关键依据。本专利技术的目的之一在于提供一种试剂盒，所述试剂盒包括：检测RFC4基因mRNA表达水平的引物对组和/或RFC4蛋白含量检测试剂，所述引物对组选自下列引物对中的至少一对：(1)引物对1：上游引物序列如SEQIDNO：1所示，下游引物序列如SEQIDNO：2所示；(2)引物对2：上游引物序列如SEQIDNO：3所示，下游引物序列如SEQIDNO：4所示；(3)引物对3：上游引物序列如SEQIDNO：5所示，下游引物序列如SEQIDNO：6所示；(4)引物对4：上游引物序列如SEQIDNO：7所示，下游引物序列如SEQIDNO：8所示；(5)引物对5：上游引物序列如SEQIDNO：9所示，下游引物序列如SEQIDNO：10所示；(6)引物对6：上游引物序列如SEQIDNO：11所示，下游引物序列如SEQIDNO：12所示；(7)引物对7：上游引物序列如SEQIDNO：13所示，下游引物序列如SEQIDNO：14所示；(8)引物对8：上游引物序列如SEQIDNO：15所示，下游引物序列如SEQIDNO：16所示；(9)引物对9：上游引物序列如SEQIDNO：17所示，下游引物序列如SEQIDNO：18所示；(10)引物对10：上游引物序列如SEQIDNO：19所示，下游引物序列如SEQIDNO：20所示；(11)引物对11：上游引物序列如SEQIDNO：21所示，下游引物序列如SEQIDNO：22所示；(12)引物对12：上游引物序列如SEQIDNO：23所示，下游引物序列如SEQIDNO：24所示；(13)引物对13：上游引物序列如SEQIDNO：25所示，下游引物序列如SEQIDNO：26所示；(14)引物对14：上游引物序列如SEQIDNO：27所示，下游引物序列如SEQIDNO：28所示。在上下文中，所述引物对组是指用于在PCR中合成RFC4基因cDNA链的PCR引物，用于检测RFC4基因表达水平。作为优选地，所述RFC4蛋白含量检测试剂选自RFC4单克隆抗体和/或RFC4多克隆抗体。作为优选地，所述RFC4蛋白含量检测试剂选自Invitrogen公司的RFC4单克隆抗体(货号为PA5-21538)、Abcam公司的RFC4单克隆抗体(货号为ab156780)、Abcam公司的RFC4多克隆抗体(货号为ab96852)种的一种或多种。进一步地，所述试剂盒还包括人正常的直肠组织或细胞的总RNA和总蛋白。进一步地，所述试剂盒还包括PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。作为优选地，所述荧光底物选自SyberGreen或荧光标记的探针。本专利技术的目的之二在于提供一种组合物在制备用于检测癌症放疗敏感性和/或疗效预测的试剂盒及其在疗效预测上的应用，所述组合物包括：检测RFC4基因mRNA表达水平的引物对组和/或RFC4蛋白含量检测试剂，所述引物对组选自下列引物对中的至少一对：(1)引物对1：上游引物序列如SEQIDNO：1所示，下游引物序列如SEQIDNO：2所示；(2)引物对2：上游引物序列如SEQIDNO：3所示，下游引物序列如SEQIDNO：4所示；(3)引物对3：上游引物序列如SEQIDNO：5所示，下游引物序列如SEQIDNO：6所示；(4)引物对4：上游引物序列如SEQIDNO：7所示，下游引物序列如SEQIDNO：8所示；(5)引物对5：上游引物序列如SEQIDNO：9所示，下游引物序列如SEQIDNO：10所示；(6)引物对6：上游引物序列如SEQIDNO：11所示，下游引物序列如SEQIDNO：12所示；(7)引物对7：上游引物序列如SEQIDNO：13所示，下游引物序列如SEQIDNO：14所示；(8)引物对8：上游引物序列如SEQIDNO：15所示，下游引物序列如SEQIDNO：16所示；(9)引物对9：上游引物序列如SEQIDNO：17所示，下游引物序列如SEQIDNO：18所示；(10)引物对10：上游引物序列如SEQIDNO：19所示，下游引物序列如SEQIDNO：20所示；(11)引物对11：上游引物序列如SEQIDNO：21所示，下游引物序列如SEQIDNO：22所示；(12)引物对12：上游引物序列如SEQIDNO：23所示，下游引物序列如SEQIDNO：24所示；(13)引物对13：上游引物序列如SEQIDNO：25所示，下游引物序列如SEQIDNO：26所示；(14)引物对14：上游引物序列如SEQIDNO：27所示，下游引物序列如SEQIDNO：28所示。作为优选地，所述RFC4蛋白含量检测试剂选自RFC4单克隆抗体和/或RFC4多克隆抗体。作为优选地，所述RFC4蛋白含量检测试剂选自Invitrogen公司的RFC4单克隆抗体(货号为PA5-21538)、Abcam公司的RFC4单克隆抗体(货号为ab156780)、Abcam公司的RFC4多克隆抗体(货号为ab96852)种的一种或多种。作为优选地，所述癌症为肠癌，最优选为直肠癌和/或结肠癌。作为优选地，所述肠癌为局部进展期直肠癌。进一步地，所述试剂盒还包括人正常的直肠组织或细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测癌症放疗敏感性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：检测RFC4基因mRNA表达水平的引物对组和/或RFC蛋白含量检测试剂，所述引物对组选自下列引物对中的至少一对：(1)引物对1：上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物序列如SEQ ID NO：2所示；(2)引物对2：上游引物序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物序列如SEQ ID NO：4所示；(3)引物对3：上游引物序列如SEQ ID NO：5所示，下游引物序列如SEQ ID NO：6所示；(4)引物对4：上游引物序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物序列如SEQ ID NO：8所示；(5)引物对5：上游引物序列如SEQ ID NO：9所示，下游引物序列如SEQ ID NO：10所示；(6)引物对6：上游引物序列如SEQ ID NO：11所示，下游引物序列如SEQ ID NO：12所示；(7)引物对7：上游引物序列如SEQ ID NO：13所示，下游引物序列如SEQ ID NO：14所示；(8)引物对8：上游引物序列如SEQ ID NO：15所示，下游引物序列如SEQ ID NO：16所示；(9)引物对9：上游引物序列如SEQ ID NO：17所示，下游引物序列如SEQ ID NO：18所示；(10)引物对10：上游引物序列如SEQ ID NO：19所示，下游引物序列如SEQ ID NO：20所示；(11)引物对11：上游引物序列如SEQ ID NO：21所示，下游引物序列如SEQ ID NO：22所示；(12)引物对12：上游引物序列如SEQ ID NO：23所示，下游引物序列如SEQ ID NO：24所示；(13)引物对13：上游引物序列如SEQ ID NO：25所示，下游引物序列如SEQ ID NO：26所示；(14)引物对14：上游引物序列如SEQ ID NO：27所示，下游引物序列如SEQ ID NO：28所示。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测癌症放疗敏感性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：检测RFC4基因mRNA表达水平的引物对组和/或RFC蛋白含量检测试剂，所述引物对组选自下列引物对中的至少一对：(1)引物对1：上游引物序列如SEQIDNO：1所示，下游引物序列如SEQIDNO：2所示；(2)引物对2：上游引物序列如SEQIDNO：3所示，下游引物序列如SEQIDNO：4所示；(3)引物对3：上游引物序列如SEQIDNO：5所示，下游引物序列如SEQIDNO：6所示；(4)引物对4：上游引物序列如SEQIDNO：7所示，下游引物序列如SEQIDNO：8所示；(5)引物对5：上游引物序列如SEQIDNO：9所示，下游引物序列如SEQIDNO：10所示；(6)引物对6：上游引物序列如SEQIDNO：11所示，下游引物序列如SEQIDNO：12所示；(7)引物对7：上游引物序列如SEQIDNO：13所示，下游引物序列如SEQIDNO：14所示；(8)引物对8：上游引物序列如SEQIDNO：15所示，下游引物序列如SEQIDNO：16所示；(9)引物对9：上游引物序列如SEQIDNO：17所示，下游引物序列如SEQIDNO：18所示；(10)引物对10：上游引物序列如SEQIDNO：19所示，下游引物序列如SEQIDNO：20所示；(11)引物对11：上游引物序列如SEQIDNO：21所示，下游引物序列如SEQIDNO：22所示；(12)引物对12：上游引物序列如SEQIDNO：23所示，下游引物序列如SEQIDNO：24所示；(13)引物对13：上游引物序列如SEQIDNO：25所示，下游引物序列如SEQIDNO：26所示；(14)引物对14：上游引物序列如SEQIDNO：27所示，下游引物序列如SEQIDNO：28所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RFC4蛋白含量检测试剂选自RFC4单克隆抗体和/或RFC4多克隆抗体。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括人正常的直肠组织或细胞的总RNA和总蛋白。4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。5.一种组合物在制备用于检测癌症放疗敏感性和/或疗效预测的试剂盒中的应用，所述组合物包括：检测RFC4基因mRNA表达水平的引物对组和/或RFC4蛋白含量检测试剂，所述引物对选自下列引物对中的至少一对：(1)引物对1：上游引物序列如SEQIDNO：1所示，下游引物序列如SEQIDNO：2所示；(2)引物对2：上游引物序列如SEQIDNO：3所示，下游引物序列如SEQIDNO：4所示；(3)引物对3：上游引物序列如SEQIDNO：5所示，下游引物序列如SEQIDNO：6所示；(4)引物对4：上游引物序列如SEQIDNO：7所示，下游引物序列如SEQIDNO：8所示；(5)引物对5：上游引物序列如SEQIDNO：9所示，下游引物序列如SEQIDNO：10所示；(6)引物对6：上游引物序列如SEQIDNO：11所示，下游引物序列如SEQIDNO：12所示；(7)引物对7：上游引物序列如SEQIDNO：13...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘然义，岳欣，王雪涔，黄文林，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心，
类型：发明
国别省市：广东,44