双启动子级联调控基因表达载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种双启动子级联调控基因表达载体及其构建方法与应用。所述双启动子级联调控基因表达载体携带有核酸构建体，所述核酸构建体包含两个具有级联调控关系的基因表达盒，表达盒I由诱导型启动子驱动，表达盒II由强启动子驱动；其中，所述诱导型启动子受特定物质诱导表达，其下游基因编码可调控所述强启动子表达的调控元件；所述强启动子的下游基因为目的基因。本发明专利技术双启动子级联调控模式的成功建立，不仅为提高基因工程菌对环境污染物的灵敏度提供一种新方法和新思路，同时，级联调控模式对于报告基因表达的高效放大作用也使得这种模式可应用于启动子的筛选分析或蛋白质的相互作用等研究中，为基因表达调控研究提供新的技术便利。

Construction and application of double promoter cascade regulatory gene expression vector

The invention provides a double promoter cascade regulatory gene expression vector, a construction method and application thereof. The double promoter cascade regulatory gene expression vector carries a nucleic acid construct, which comprises two gene expression cassettes with cascade regulatory relationship. The expression cassette I is driven by an inducible promoter and the expression cassette II is driven by a strong promoter. The inducible promoter is induced by a specific substance and its downstream gene coding can regulate the expression of the strong promoter. The downstream gene of the strong promoter is the target gene. The successful establishment of the double promoter cascade regulation mode of the invention not only provides a new method and a new idea for improving the sensitivity of genetic engineering bacteria to environmental pollutants, but also enables the cascade regulation mode to amplify the expression of reporter genes efficiently, which can be applied to the study of promoter screening analysis or protein interaction, and so on, for the research of gene expression regulation. Provide new technical facilities.

【技术实现步骤摘要】
双启动子级联调控基因表达载体及其构建方法与应用
本专利技术属于环境生物
，具体地说，涉及一种双启动子级联调控基因表达载体及其构建方法与应用。
技术介绍
某些微生物长期生活在含有某种化学物质的环境中，在其基因组中含有对该化学物质的特异诱导基因、降解基因或抗性基因。将报告基因与这些基因融合，以诱导基因、降解基因或抗性基因作为启动子来调控报告基因的表达，然后导入选定的合适的宿主菌，构成用于环境监测的基因工程菌。当针对的化学物质作用于基因工程菌时，可诱导启动报告基因表达，根据报告基因的表达情况就可以判断出环境污染物的浓度变化或生物毒性。许多环境污染物是无阈化合物(即接触就对人体有危害)，在环境中也是微量存在，不易监测，因此，在筛选和构建这类用于环境监测的微生物菌株时，灵敏性、准确性和简便性一直是研究的重点。在这类基因工程菌的构建中，启动子和报告基因是关键因素，启动子决定了基因工程菌对于环境污染物的敏感性和特异性，选用的报告基因决定了检测的简便性。现有研究中，大多采用单一的启动子系统调控报告基因的表达，这些特异性启动子系统诱导蛋白表达的能力远远低于常用的强效启动子如tac启动子、PL启动本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸构建体，其特征在于，其包含两个具有级联调控关系的基因表达盒，分别为表达盒I、表达盒II；所述表达盒I由诱导型启动子驱动，所述表达盒II由强启动子驱动；其中，所述诱导型启动子受特定物质诱导表达；所述诱导型启动子的下游基因编码可增强或开启所述强启动子表达的调控元件；所述强启动子的下游基因为目的基因。

【技术特征摘要】
1.一种核酸构建体，其特征在于，其包含两个具有级联调控关系的基因表达盒，分别为表达盒I、表达盒II；所述表达盒I由诱导型启动子驱动，所述表达盒II由强启动子驱动；其中，所述诱导型启动子受特定物质诱导表达；所述诱导型启动子的下游基因编码可增强或开启所述强启动子表达的调控元件；所述强启动子的下游基因为目的基因。2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述诱导型启动子的下游基因为T7RNA聚合酶基因；所述强启动子为T7启动子，或者其他对调控元件具有高度专一性的、可以被调控元件开启表达的强启动子；所述目的基因包括报告基因；优选地，所述报告基因选自荧光蛋白类基因、β-半乳糖苷酶基因或荧光素酶基因，更优选荧光蛋白类基因，最优选绿色荧光蛋白基因。3.根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述诱导型启动子包括可由特定环境污染物调控的启动子，优选砷诱导型启动子、镉诱导型启动子或铅诱导型启动子。4.根据权利要求3所述的核酸构建体，其特征在于，所述表达盒I包含砷诱导型启动子Pars和T7RNA聚合酶基因，所述表达盒II包含T7启动子和荧光报告基因；其中，所述砷诱导型启动子Pars的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。5.含有权利要求1-4任一项所述核酸构建体的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。6.双启动子级联调控基因表达载体，其特征在于，所述表达载体携带有权利要求1-4任一项所述的核酸构建体；和/或所述表达载体还包括抗性基因、复制子及T7溶菌酶基因；优选地，所述抗性基因选自氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因或氯霉素抗性基因，更优选氯霉素抗性基因；所述复制子选自pMB1复制子、CoE1复制子、pSC101复制子或p15A复制子，更优选p15A复制子；所述T7溶菌酶基因来自pLysS质粒或pLysE质粒，更优选pLysS质粒。7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述核酸构建体的两个基因表达盒结构如下：表达盒I：砷诱导型启动子Pars-T7RNA聚合酶基因-rrnBT1T2终止子；表达盒II：T7启动子-荧光报告基因-T7终止子。8.权利要求7所述表达载体的构建方法，其特征在于，包...

【专利技术属性】
技术研发人员：李琴，王菲菲，陈世武，张艳平，车飞，赵鑫，王延红，朱静，
申请(专利权)人：中国环境科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11