一种转氨酶-PLP共固定化酶及其制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及以环氧树脂为载体，将含有转氨酶与辅酶磷酸吡哆醛(简称PLP)一起共价固定化的获得的转氨酶‑PLP共固定化酶及其制备方法，以及该共固定化转氨酶在制备西他列汀药物手性中间体中的应用。本发明专利技术采用转氨酶‑PLP共固定化酶为催化剂，稳定性好，使用寿命长，有机溶剂耐受性好，可多次重复利用，并且反应过程中无需昂贵的外源辅酶添加，大幅度降低生产成本。本方法工艺简单，成本低廉，产品产率与纯度高，在西他列汀手性中间体的工业化生产中具有极高应用价值。

A Co-immobilized Transaminase-PLP Enzyme and Its Preparation and Application

The present invention relates to a transaminase and PLP co-immobilized enzyme obtained by covalently immobilizing transaminase and coenzyme pyridoxal phosphate (PLP) with epoxy resin as carrier, and its preparation method, as well as the application of the co-immobilized transaminase in the preparation of chiral intermediates of statin drugs. The invention uses transaminase and PLP co-immobilized enzyme as catalyst, has good stability, long service life, good tolerance of organic solvent, can be reused for many times, and does not need expensive exogenous coenzyme addition in the reaction process, thus greatly reducing production cost. The method has the advantages of simple process, low cost, high yield and purity, and has high application value in industrialized production of chiral intermediates of statin.

【技术实现步骤摘要】
一种转氨酶-PLP共固定化酶及其制备与应用(一)
本专利技术涉及一种转氨酶-PLP共固定化酶及其制备方法，以及其在不对称还原制备西他列汀中间体中的应用。(二)
技术介绍
糖尿病是与心血管和恶性肿瘤并列的三大非传染性慢性疾病之一，严重危害人类健康和社会发展。世界卫生组织于2016年首次发布全球糖尿病报告，显示全球糖尿病成年人患者近40年内增加了3倍，其中多数生活在发展中国家。2014年全球18岁以上人群中，糖尿病患者达4.22亿人，占全球总人口的8.5％。中国成年人患糖尿病率接近10％。西他列汀(Sitagliptin)，是一种新型二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-4)抑制剂类药物，可有效治疗Ⅱ型糖尿病，与传统药物相比，具有血糖控制稳定、无体重增加及引起水肿等常见副作用的优点。年均全球的销售额均在40亿美元以上，是全球最畅销的Ⅱ型糖尿病治疗药物，市场价值巨大。西他列汀的合成关键在于手性胺基团的构建，传统的合成方法是以手性铑化物为催化剂不对称氢化烯胺获得手性胺结构，制备西他列汀。该方法存在产物光学纯度低、废液重金属含量高、反应的设备要求较高、能耗大等不足。相比化学合成，利用转氨酶(Aminotransferase，transaminase，ATs，EC2.6.1.X)催化不对称氨基转换反应制备合成手性胺，具有条件温和、效率高，化学选择性、区域选择性以及对映体选择性高等突出优点。2010年Merck公司开发了ω-转氨酶催化制备西他列汀的绿色合成路线，该路线与不对称氢化法相比提高了53％的产量和10％～13％的转化率，同时减少了19％的废物排放(2010,SavileCK,Science)。2017年程峰等人筛选、改造得到一株新型R型ω-转氨酶，在辅酶磷酸吡哆醛(Pyridoxal5'-monophosphate，PLP)的参与下，直接催化异丙胺和西他列汀前体酮进行转氨反应生成西他列汀，其转化率可以达到91％，e.e.>99％(CN201710543569.6)。但该技术在工业应用中仍显现诸多不足，如游离转氨酶稳定性低，后期速率下降；酶制剂不可循环利用；反应液中存在大量游离蛋白，萃取困难，产物收率低等问题。利用固定化技术将酶固定在载体上，可增强酶的稳定性，提高转氨酶对有机溶剂、机械剪切力耐受，避免细胞破裂后内容物释放至反应体系，降低对产物纯化工艺造成的影响，达到生物催化剂循环利用，简化后处理工艺，降低“三废”排放等目标。2007年Yi将转氨酶固定在壳聚糖上，转氨酶的固定化效率为54.3％，在温度37-50℃条件下固定化酶具有良好的热稳定性(Yi，etal.,2007,ProcessBiochemistry)。2010年Dominik通过溶胶-凝胶/Celite545固定转氨酶(包埋法)制备固定化转氨酶，重复使用8个批次后，酶活保留78％，固载酶量较少，回收批次较少，无法实现工业化应用(Dominiketal.,2010,JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic)。2012年Truppo等人采用疏水吸附树脂对转氨酶进行固定化，西他列汀前体酮底物浓度200g/L，反应10个批次，反应时间200h，转化率大于80％，且ee值大于99％，酶活几乎没有损失。但是所用固定化载体价格昂贵，反应批次仍未达到工业应用水平(Truppoetal.,2012,ChenCatChem)。2016年HongHuaJia通过合成了平均粒径在30-40nm之间的磁性PVA-Fe3O4纳米粒子作载体，并用戊二醛交联固定转氨酶。在催化R-α-MBA时达到更宽的pH范围为6-8，并且在60℃下也具有更好的热稳定性。但是其制备固定化载体时所用温度较高以及试剂(浓盐酸)比较危险且制备步骤比较繁琐；反应在进行到13批后酶活下降到50％；反应转化率较低只有80％左右(Jiaetal.,2016,BiotechnologyReports)。目前国内外在转氨酶固定化及制备包括西他列汀在内的手性胺中间体合成研究较少，相关研究存在着酶活回收率低、固定化酶制备成本高、催化活力不理想、稳定性差等问题，严重限制了固定化生物催化剂在手性胺药物中间体的生产中的应用。而且用于西他列汀的生物合成的报道过均需添加额外的辅酶PLP，这样就进一步加大了生产成本，增加了工业化生产的难度。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种以环氧树脂为载体，将含有转氨酶与辅酶磷酸吡哆醛(简称PLP)一起共价固定化获得转氨酶-PLP共固定化酶的方法，以及该共固定化转氨酶在制备西他列汀药物手性中间体中的应用。本专利技术采用的技术方案是：一种转氨酶-PLP共固定化酶，其特征在于所述共固定酶由按下方法制备获得：(1)SEQIDNO.1所示核苷酸(其编码氨基酸序列如SEQIDNO.1所2所示)序列转化到宿主菌大肠杆菌中，得到基因工程菌经发酵培养，获得湿菌体悬浮于的pH7.0～9.0缓冲液中得到菌悬液，菌悬液经细胞破碎、离心，得到转氨酶粗酶液；(2)环氧树脂用蒸馏水浸泡12～18h，抽滤取滤饼，得到预处理后的环氧树脂备用；(3)粗酶液中加入0.1～8mM的辅酶磷酸吡哆醛，加入步骤(2)预处理后的环氧树脂，环氧树脂添加量为20～30mg/100mL粗酶液；(4)在15～45℃、200～300rpm条件下水浴搅拌固定化6～48h，抽滤，滤饼用pH7.0～9.0缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即得所述转氨酶-PLP共固定化酶。本专利技术方法采用共价固定化技术，可实现共固定化转氨酶与辅酶的高效制备，所得共固定化转氨酶酶活回收率高、稳定性好、有机溶剂耐受性强、成本低廉。将所得共固定化转氨酶应用于催化西他列汀前体酮反应体系中，实现了化西他列汀的连续稳定生产，大幅降低反应成本。所述pH7.0～9.0缓冲液为Tris-HCl、甘氨酸-NaOH、PB、Na2CO3-NaHCO3或三乙醇胺-HCl缓冲液，优选为pH9.0的Tris-HCl缓冲液。步骤(1)菌悬液浓度为50～150g/L，优选为100g/L。步骤(1)湿菌体按如下方法制得：将转氨酶基因工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm下培养8h作为种子液，再以体积浓度10％接种量(种子液占发酵培养基体积百分比)接种至新鲜的含有终浓度50μ/mL卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃、500rpm下培养至菌体OD600达6～8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养11h，发酵液4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即获得转氨酶基因工程菌湿菌体。发酵培养基配方(g/L)：蛋白胨20，酵母粉15，NaCl10，(NH4)2SO43，甘油20，KH2PO41.36，K2HPO4·3H2O2.28，MgSO4·7H2O0.7，pH7.0。本专利技术中，所述树脂为西安蓝晓科技公司生产的环氧树脂，型号为LX-1000HFA。本专利技术还涉及所述转氨酶-PLP共固定化酶的制备方法，所述方法包括：(1)SEQIDNO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中，得到基因工程菌经发酵培养，获得湿菌体悬浮于的pH7.0～9.0缓冲液中得到菌悬液，菌悬液经细胞破碎、离心，得到转氨酶粗酶液；(2)环氧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转氨酶‑PLP共固定化酶，其特征在于所述共固定酶由按下方法制备获得：(1)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中，得到基因工程菌经发酵培养，获得湿菌体悬浮于的pH 7.0～9.0缓冲液中得到菌悬液，菌悬液经细胞破碎、离心，得到转氨酶粗酶液；(2)环氧树脂用蒸馏水浸泡12～18h，抽滤取滤饼，得到预处理后的环氧树脂备用；(3)粗酶液中加入0.1～8mM的辅酶磷酸吡哆醛，加入步骤(2)预处理后的环氧树脂，环氧树脂添加量为20～30mg/100mL粗酶液；(4)在15～45℃、200～300rpm条件下水浴搅拌固定化6～48h，抽滤，滤饼用pH 7.0～9.0缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即得所述转氨酶‑PLP共固定化酶。

【技术特征摘要】
1.一种转氨酶-PLP共固定化酶，其特征在于所述共固定酶由按下方法制备获得：(1)SEQIDNO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中，得到基因工程菌经发酵培养，获得湿菌体悬浮于的pH7.0～9.0缓冲液中得到菌悬液，菌悬液经细胞破碎、离心，得到转氨酶粗酶液；(2)环氧树脂用蒸馏水浸泡12～18h，抽滤取滤饼，得到预处理后的环氧树脂备用；(3)粗酶液中加入0.1～8mM的辅酶磷酸吡哆醛，加入步骤(2)预处理后的环氧树脂，环氧树脂添加量为20～30mg/100mL粗酶液；(4)在15～45℃、200～300rpm条件下水浴搅拌固定化6～48h，抽滤，滤饼用pH7.0～9.0缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即得所述转氨酶-PLP共固定化酶。2.如权利要求1所述的转氨酶-PLP共固定化酶，其特征在于所述pH7.0～9.0缓冲液为Tris-HCl、甘氨酸-NaOH、PB、Na2CO3-NaHCO3或三乙醇胺-HCl缓冲液。3.如权利要求1所述的转氨酶-PLP共固定化酶，其特征在于步骤(1)菌悬液浓度为50～150g/L。4.如权利要求1所述的转氨酶-PLP共固定化酶，其特征在于步骤(1)湿菌体按如下方法制得：将转氨酶基因工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm下培养8h，再以体积浓度10％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μ/mL卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃、500rpm下培养至菌体OD600达6～8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养11h，发酵液4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即获得转氨酶基因工程菌湿菌体。5.权利要求1所述转氨酶-PLP共固定化酶的制备方法，所述方法包括：(1)SEQIDNO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中，得到基因工程菌经发酵培养，获得湿菌体悬浮于的...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，张晓健，郑裕国，范浩浩，程峰，贾东旭，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33