呕吐毒素半抗原及其制备方法、人工抗原、试剂盒及呕吐毒素的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种呕吐毒素半抗原及其制备方法、人工抗原、试剂盒及呕吐毒素的检测方法。其中，所述呕吐毒素半抗原的化学结构式(Ⅰ)如下：

Vomitoxin hapten and its preparation method, artificial antigen, kit and detection method of vomitoxin

The invention relates to a vomiting toxin hapten and a preparation method thereof, an artificial antigen, a kit and a detection method of vomiting toxin. The chemical structure formula of the vomitoxin hapten (I) is as follows:

【技术实现步骤摘要】
呕吐毒素半抗原及其制备方法、人工抗原、试剂盒及呕吐毒素的检测方法
本专利技术涉及酶联免疫检测
，特别是涉及一种呕吐毒素半抗原及其制备方法、人工抗原、试剂盒及呕吐毒素的检测方法。
技术介绍
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DeoxynivaLenol)又称呕吐毒素(Vomitoxin)，其属于霉菌的单端孢菌素族，由某些镰刀霉真菌属产生。呕吐毒素多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实样本中，含量通常是mg/kg级，由于其具有高的细胞毒素及免疫抑制性质，对人类及动物构成了健康威胁。传统的呕吐毒素的主要检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FD)，以及高效液相色谱-质谱检测法(HPLC-MS)，上述方法均存在检测限太低，设备操作复杂等问题。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种快速、准确、方便的呕吐毒素半抗原及其制备方法、人工抗原、试剂盒及呕吐毒素的检测方法。一种呕吐毒素半抗原，所述呕吐毒素半抗原的化学结构式(Ⅰ)如下：上述呕吐毒素半抗原为人工构建的新型呕吐毒素半抗原，该抗原最大程度保留了呕吐毒素的官能团的结构特征，经此半抗原制备得到的呕吐毒素人工抗原能够发挥出最佳的构效优势，从而得到特异性强的抗体。本专利技术还提供一种呕吐毒素半抗原的制备方法，其包括如下步骤：在pH为2.8-3.2下，将呕吐毒素和对肼基苯甲酸盐酸盐反应。上述制备方法简单，在pH为2.8-3.2下，将对肼基苯甲酸盐酸盐加入呕吐毒素中反应制备人工半抗原，对肼基苯甲酸盐酸盐起到间隔臂作用，还能够防止大分子载体蛋白对半抗原的屏蔽效应，即在半抗原与载体结合时阻止抗原决定簇被包埋在卷曲凹陷的大分子结构中，不会对呕吐毒素分子抗原决定簇的结构造成不利影响，抗原决定簇的完全外露可以高效产生对应抗体。其中一个实施例中，所述呕吐毒素与所述对肼基苯甲酸盐酸盐的质量比为295-300:185-200。本专利技术还提供一种呕吐毒素人工抗原，所述人工抗原为本专利技术所述的呕吐毒素半抗原与第一载体蛋白的偶联物。其中一个实施例中，所述第一载体蛋白为活化牛血清白蛋白。本专利技术还提供一种呕吐毒素酶联免疫试剂盒，其包括采用本专利技术所述的人工抗原为免疫原得到的抗体。其中一个实施例中，还包括包被有包被原的酶标板。其中一个实施例中，所述包被原包括本专利技术所述的呕吐毒素半抗原与第二载体蛋白的偶联物。其中一个实施例中，所述第二载体蛋白为卵清蛋白。本专利技术还提供一种呕吐毒素的检测方法，其包括如下步骤：将待测样本进行前处理；用本专利技术任一实施方式中所述的呕吐毒素酶联免疫试剂盒对经过前处理的待测样本进行酶联免疫法检测；以及分析检测结果。本专利技术呕吐毒素酶联免疫试剂盒检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施例的限制。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本专利技术一实施例提供了一种新型的呕吐毒素半抗原，所述呕吐毒素半抗原的化学结构式(Ⅰ)如下：呕吐毒素的相对分子质量为296.32，为小分子物质，小分子物质在免疫反应中，只具有反应原性不具备免疫原性，需要与大分子载体蛋白才具有免疫原性，才能刺激机体发生免疫应答，从而产生抗体。上述呕吐毒素半抗原为人工构建的新型呕吐毒素半抗原，该抗原最大程度保留了呕吐毒素的官能团的结构特征，经此半抗原制备得到的呕吐毒素人工抗原能够发挥出最佳的构效优势，从而得到特异性强的抗体。本专利技术一实施例还提供了一种呕吐毒素半抗原的制备方法，其包括如下步骤：在pH为2.8-3.2下，将呕吐毒素和对肼基苯甲酸盐酸盐反应。在其中一个实施例中，所述呕吐毒素与所述对肼基苯甲酸盐酸盐的质量比为295-300:185-200。进一步地，所述呕吐毒素与所述对肼基苯甲酸盐酸盐的质量比为296:188。在其中一个实施例中，称取呕吐毒素(DON)标准样品296mg，溶于2mL的1mol/L柠檬酸缓冲液中，用盐酸调pH至3.0，加入对肼基苯甲酸盐酸盐188mg中，在室温下搅拌3h。3000转/min离心得到黄色沉淀，经真空干燥后得到半抗原，反应式如下：上述制备方法简单，在pH为2.8-3.2下，将对肼基苯甲酸盐酸盐加入呕吐毒素中反应制备人工半抗原，对肼基苯甲酸盐酸盐起到间隔臂作用，还能够防止大分子载体蛋白对半抗原的屏蔽效应，即在半抗原与载体结合时阻止抗原决定簇被包埋在卷曲凹陷的大分子结构中，不会对呕吐毒素分子抗原决定簇的结构造成不利影响，抗原决定簇的完全外露可以高效产生对应抗体。本专利技术一是实施例还提供一种呕吐毒素人工抗原，所述人工抗原为本专利技术一实施例所述的呕吐毒素半抗原与第一载体蛋白结合的偶联物。在其中一个实施例中，所述第一载体蛋白为活化牛血清白蛋白(CBSA)。包含本专利技术一实施方式中的呕吐毒素半抗原的呕吐毒素人工抗原抗原决定簇的完全外露可以高效产生对应抗体。在其中一个实施例中，人工抗原的制备方法如下：S1、称取本专利技术所述的呕吐毒素半抗原30mg，溶解于0.5mL的水中，制得呕吐毒素半抗原溶液。S2、分别称取乙基二甲氨基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)20.0mg、N-羟基琥珀酰亚胺11.6mg，溶解于0.5mL的水中得到混合液，将混合液逐滴加入到S1制得的呕吐毒素半抗原溶液中，得到溶液A。S3、制备活化牛血清白蛋白(CBSA)溶液：将100μL质量浓度为10％的乙二胺溶液、5mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和5mg的乙基二甲氨基碳化二亚胺盐酸盐加入2mL浓度为5mg/mL的含牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液(pH＝7.4)中，室温搅拌6h，之后透析得到4mL的CBSA溶液。S4、在CBSA溶液中滴加溶液A，然后在4℃下缓慢搅拌反应20h得产物B。S5、将产物B用pH7.2的0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS)在4℃下透析72h，得到人工抗原，即为免疫原。其中，CBSA为蛋白BSA与乙二胺联结而得到。将乙二胺联结到载体蛋白BSA上，这样大大增加载体蛋白的游离氨基数目，从而增加了载体蛋白上的氨基和呕吐毒素半抗原上的羧基的结合率。该方法可以大幅度提高抗体的成功获取率。本专利技术还提供一种呕吐毒素酶联免疫试剂盒，其包括本专利技术一实施例所述的人工抗原为免疫原得到的抗体。所述抗体优选为一抗工作液，具体的，所述一抗工作液的制备方法包括：以所述呕吐毒素人工抗原为免疫原免疫动物得到抗血清，从所述抗血清中纯化得到呕吐毒素单克隆抗体，再将单克隆抗体按照一定比例稀释成稀释液，即得到一抗工作液。优选地，免疫动物为BALb/c小鼠。可以理解，本专利技术的一抗工作液采用本领域常规的单抗制备方法即可，将末次免疫后血清效价为1:90000以上的实验Balb/c小鼠处死，分离血清，制备好后分装冻存。本专利技术提供的呕吐毒素酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种呕吐毒素半抗原，其特征在于，所述呕吐毒素半抗原的化学结构式(Ⅰ)如下：

【技术特征摘要】
1.一种呕吐毒素半抗原，其特征在于，所述呕吐毒素半抗原的化学结构式(Ⅰ)如下：2.一种权利要求1所述的呕吐毒素半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：在pH为2.8-3.2下，将呕吐毒素和对肼基苯甲酸盐酸盐反应，得到所述呕吐毒素半抗原。3.根据权利要求2所述的呕吐毒素半抗原的制备方法，其特征在于，所述呕吐毒素与所述对肼基苯甲酸盐酸盐的质量比为295-300:185-200。4.一种呕吐毒素人工抗原，其特征在于，所述人工抗原为权利要求1所述的呕吐毒素半抗原与第一载体蛋白的偶联物。5.根据权利要求4所述的呕吐毒素人工抗原，其特征在于，所述第一载体蛋白为活化牛血清白蛋白。6.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆鹏杰，陈霞，王紫菲，陈银辉，周爽，李敬光，赵云峰，
申请(专利权)人：国家食品安全风险评估中心，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京,11