一种在水稻花药与花粉中特异表达的启动子PCHF17及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种在水稻花药与花粉中特异表达的启动子PCHF17及其应用，涉及基因工程与分子生物学领域。本发明专利技术启动子PCHF17具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，本发明专利技术进一步提供含有启动子PCHF17的表达载体、基因表达盒，工程菌或细胞系。本发明专利技术还提供了扩增花药与花粉特异性启动子的引物对。本发明专利技术的花药与花粉特异启动子为水稻内源基因，对水稻基因工程十分有利，能够驱动外源基因在花药与花粉中特异性表达且表达水平精确，提供了驱动外源基因在水稻花药与花粉中特异性表达的新方法。

A Promoter PCHF17 Specifically Expressed in Rice Anther and Pollen and Its Application

The invention discloses a promoter PCHF17 specifically expressed in Rice Anther and pollen and its application, which relates to the field of genetic engineering and molecular biology. The promoter PCHF17 of the invention has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO.1. The invention further provides the expression vector, gene expression box, engineering bacteria or cell line containing the promoter PCHF17. The invention also provides primer pairs for amplifying anther and pollen specific promoters. The anther and pollen specific promoter of the invention is an endogenous gene of rice, which is very advantageous to rice genetic engineering, can drive the specific expression of exogenous genes in anther and pollen and has accurate expression level, and provides a new method for driving the specific expression of exogenous genes in Rice Anther and pollen.

【技术实现步骤摘要】
一种在水稻花药与花粉中特异表达的启动子PCHF17及其应用
本专利技术涉及基因工程与分子生物学领域，具体地说，涉及水稻花药与花粉特异性启动子PCHF17及其应用。
技术介绍
转录调控是植物基因表达调控的主要形式之一，由顺式作用元件和反式作用因子协调完成。启动子是植物基因转录调控中最重要顺式元件之一，一般位于基因5′端上游区，是RNA聚合酶及一些反式作用因子的识别与结合位点。启动子主要包含核心启动子区与转录调控区两个功能区。核心启动子区是启动转录的最短启动子片段，一般为40nt，是一段被RNA聚合酶家族I、II和III识别和结合的DNA序列。此区域包含一些重要的功能元件，能够准确的定位转录起点及方向，是基因表达调控的基础。转录调控区域位于核心启动子的上游(或下游)，可与特异的转录因子相结合从而对转录的时空和强弱起调控作用，如增强子和沉默子等。深入研究启动子的表达模式既有利于理解基因的表达调控机制和生物学功能，又有助于控制外源基因的表达。启动子按其表达方式可分为组成型启动子、诱导型启动子和时空特异型启动子等三类。组成型启动子能在所有或大多数组织中启动基因转录，使基因表达具有时空持续性和表达量恒定性。烟草花叶病毒的35S启动子，水稻的Actin启动子以及玉米的Ubiquitin启动子都属于组成型启动子。组成型启动子广泛应用于植物的基因工程研究中，用于目标基因，如抗虫和抗除草剂基因的超表达。诱导型启动子能在某些物理或化学信号的刺激下启动或大幅提高基因表达。它们具增强子、沉默子或类似功能的序列结构，并有明显的专一性。诱导型启动子根据诱导信号的不同可以分为光诱导启动子、热诱导启动子、低温诱导启动子、干旱诱导启动子、创伤诱导启动子、激素诱导启动子等。时空特异型启动子只在特定的生长阶段或部位中启动基因表达。组织特异性启动子是时空特异型启动子的一种，只在特定细胞、组织或器官中启动表达。在植物的遗传转化中运用组织特异表达的启动子控制目标基因的表达能更有效的避免使用组成型启动子带来的潜在负作用，如能减少组成型表达增加的代谢负担，降低转基因食品安全风险及对与环境的不良影响，以及重复使用相同启动子引发的基因沉默等。目前已开发的水稻组织特异启动子的种类多种多样，在根、茎、叶、种子和果实等几乎各种组织中都发现了有组织特异性表达的启动子。雄性不育是杂种优势利用的基础，是杂交水稻产业的核心技术，研究水稻育性调控的机理具有重要的理论和实践意义。花药是水稻产生成熟雄配子体(即花粉或小孢子)的器官。在花药发育的早期阶段，存在一种原生造孢细胞，该细胞经过一系列分裂和分化，产生绒毡层和花粉母细胞。绒毡层为雄配子体的发育提供营养，包括各种酶类和非酶类蛋白质，并参与花粉外壁的合成。花粉母细胞则进行减数分裂，产生四分体。四分体中的单细胞经绒毡层分泌胼胝酶的作用分离产生单倍体小孢子体。单倍体小孢子体进一步发育，到晚期时形成中央大液泡。中央大液泡将细胞核排挤到细胞边缘(称为单核靠边期)，形成细胞极性。这种细胞极性促进小孢子体进行一次不均等有丝分裂，产生一个大的营养细胞和一个小的生殖细胞。小的生殖细胞被完全包含在大的营养细胞内，形成细胞中细胞的特异现象。生殖细胞接着进行第二次有丝分裂，产生两个精细胞，形成成熟的花粉粒。因此，筛选和确定水稻花药与花粉特异启动子将为水稻的基因工程，特别是在育性调控和转基因漂移防控等方面提供新的选择。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种植物花药与花粉特异性启动子及其应用。本专利技术提供的一种植物花药与花粉特异性启动子PCHF17，其为具有：1)SEQIDNo：1所示的核苷酸序列，或2)在SEQIDNo：1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸且具有同等花药与花粉特异性启动功能的由1)衍生的核苷酸序列；或3)与SEQIDNo：1所示的核苷酸序列互补的序列。其中，2)所述的由1)衍生的核苷酸序列，与1)所述的核苷酸序列为与1)相比具有70％以上同一性、80％以上同一性、85％以上同一性、90％以上同一性、95％以上同一性、98％以上同一性或99％以上同一性，且具有同等花药与花粉特异性启动子功能的核苷酸序列。本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用与植物花药与花粉特异性启动子PCHF17核苷酸序列互补的DNA分子，因此，具有启动子活性并在严格条件下能与本专利技术启动子序列或其片段杂交的DNA序列包括在本专利技术中。其中，所述核苷酸序列互补，是指在严格条件下能与PCHF17杂交。严格条件是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因实验其它条件的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度不超过1000个核苷酸，优选地短于500个核苷酸。典型地，严格条件是在pH值7.0-8.3下盐浓度低于大约1.5MNa离子，典型地大约0.01-1.0MNa离子浓度(或其它盐类)，温度对短探针(如10-50个核苷酸)至少大约30℃，对长探针(如超过50个核苷酸)至少大约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低严格条件，例如，包括在30-35％甲酰胺、1MNaCl、l％SDS(十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液中37℃杂交，在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中50-55℃洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45％甲酰胺、1.0MNaCl、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.5×至1×SSC中55-60℃洗涤。高度严格条件，例如，包括在50％甲酰胺、1MNaCl、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.1×SSC中60-65℃洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1％-1％的SDS。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4-12小时。特别典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以从Meinkoth和Wahl(AnalBiochem，1984，138：267-284)的方程估算:Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。Tm是50％互补靶序列与完全配对探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。每1％的错配需Tm降低大约l℃；因此，Tm杂交和/或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有≥90％的同一性，Tm可以降低10℃。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度(Tm)大约5℃，且其在规定的离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。本领域普通技术人员会理本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.水稻花药与花粉特异性启动子PCHF17，其特征在于，其为具有以下任一的核苷酸序列：1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；2)在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸且具有同等花药与花粉特异性启动子的功能，由1)衍生的核苷酸序列；3)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.水稻花药与花粉特异性启动子PCHF17，其特征在于，其为具有以下任一的核苷酸序列：1)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；2)在SEQIDNO.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸且具有同等花药与花粉特异性启动子的功能，由1)衍生的核苷酸序列；3)与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。2.含有权利要求1所述水稻花药与花粉特异性启动子PCHF17的基因表达盒。3.含有权利要求1所述水稻花药与花粉特异性启动子PCHF17的表达载体。4.含有权利要求2所述表达盒或权利要求3所述表达载体的宿主细胞。5.权利要求1所述的水稻花药与花粉特异性启动子PCHF17或含有其的表达盒、表达载体或宿主细胞在驱动外源基因在植物花药与花粉中特异性表达的应用。6.权利要求1所述的水稻花药与花粉特异性启动子PCHF17或含有其的表达盒、表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄培劲，龙湍，吴春瑜，张维，刘昊，吴永忠，曾翔，李新鹏，安保光，
申请(专利权)人：海南波莲水稻基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：海南,46