一种肉类中细菌DNA提取的试剂盒及应用方法技术

本发明专利技术属于肉类产品分析检测领域，具体涉及一种肉类中细菌DNA提取的试剂盒及应用方法。本发明专利技术制备的试剂盒可用于肉类样品不增菌的条件下对细菌基因组DNA进行提取，试剂盒的核心试剂和吸附载体，包括裂解液A，结合液B，清洗液C，洗脱液D，蛋白酶K和优化后的氨基磁珠。应用方法包括：先将肉类样品中的细菌洗涤下来，以不同速率进行离心；取沉淀加入裂解液A，蛋白酶K，孵育；离心后取上清加入优化的氨基磁珠与等量结合液B振荡混匀，磁性分离，用清洗液C清洗并干燥，加洗脱液D进行洗脱，得到肉类中细菌DNA。本发明专利技术可快速从肉类样品中提取细菌DNA，无需增菌培养。提取到的细菌DNA可用于PCR扩增或LAMP检测。

A Kit for Extracting Bacterial DNA from Meat and Its Application

The invention belongs to the field of meat product analysis and detection, in particular to a kit for bacterial DNA extraction in meat and an application method. The kit can be used to extract bacterial genomic DNA without adding bacteria to meat samples. The core reagents and adsorption carriers of the kit include pyrolysis solution A, binding solution B, cleaning solution C, eluent D, protease K and optimized amino magnetic beads. The application methods include: washing the bacteria in meat samples and centrifuging them at different rates; adding pyrolysis solution A, protease K to precipitate and incubating them; adding optimized amino magnetic beads to the supernatant after centrifugation, shaking and mixing with equal amount of binding solution B, magnetic separation, cleaning and drying with cleaning solution C, and eluting with eluent D to obtain bacterial DNA in meat. The invention can quickly extract bacterial DNA from meat samples without increasing bacterial culture. The extracted bacterial DNA can be used for PCR amplification or LAMP detection.

【技术实现步骤摘要】
一种肉类中细菌DNA提取的试剂盒及应用方法
本专利技术属于肉类产品分析检测
，具体涉及一种肉类中细菌DNA提取的试剂盒及应用方法。
技术介绍
随着人们生活质量的提高，猪肉作为我国人民肉类食品的主要来源，其消费量在不断上升。然在从养殖场到市场的整个猪肉生产链中，都可造成猪肉受到致病菌污染，影响猪肉质量安全，被人类食用后可引起人兽共患病或食物中毒的发生，危害人类健康。因此，加强猪肉中致病菌的监测，具有重要的意义。污染猪肉引起食物中毒的主要致病菌包括沙门氏菌、致病性大肠杆菌、单核增生李斯特菌等。聚合酶链式反应(PCR)是一种通用的DNA检测技术，自从80年代问世以来，被广泛应用于食品安全检测和临床诊断。近年来PCR技术也被用于猪肉中致病菌的检测，但由于猪肉样品中含有肉类自身的细胞且含有脂肪、蛋白质和糖类等多种物质，目前常用的DNA抽提技术较难对肉类中细菌的DNA直接进行提取，通常需要对猪肉样品进行增菌培养，才能够获得其中细菌的DNA，增菌培养使检测时间变长，对生鲜猪肉进入市场的时间造成影响，也不足以应对一些突发的食品公共安全卫生事件。磁性纳米材料是一种新型高分子材料，不仅具有特殊的磁本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从肉类中提取细菌基因组DNA的试剂盒，其特征在于，包含下列试剂或载体，其中所述的试剂包括裂解液A、结合液B、清洗液C、洗脱液D和蛋白酶K 20μg/μL，所述的载体为纳米氨基磁珠；其中：裂解液A的配比为：4mol/L盐酸胍，10mmol/L EDTA，5mmol/L NaCl，1％Triton X‑100，pH 7.0；结合液B为无水乙醇；清洗液C为75％乙醇；洗脱液D为pH8.0的TE缓冲液；所述的纳米氨基磁珠为球体，直径为80nm，中心为Fe3O4磁性纳米粒子，外层被二氧化硅所包裹；一个氨基磁珠可以包裹一至若干个Fe3O4磁性纳米粒子；包裹一个Fe3O4磁性纳米粒子的氨基磁珠呈球体...

【技术特征摘要】
1.一种从肉类中提取细菌基因组DNA的试剂盒，其特征在于，包含下列试剂或载体，其中所述的试剂包括裂解液A、结合液B、清洗液C、洗脱液D和蛋白酶K20μg/μL，所述的载体为纳米氨基磁珠；其中：裂解液A的配比为：4mol/L盐酸胍，10mmol/LEDTA，5mmol/LNaCl，1％TritonX-100，pH7.0；结合液B为无水乙醇；清洗液C为75％乙醇；洗脱液D为pH8.0的TE缓冲液；所述的纳米氨基磁珠为球体，直径为80nm，中心为Fe3O4磁性纳米粒子，外层被二氧化硅所包裹；一个氨基磁珠可以包裹一至若干个Fe3O4磁性纳米粒子；包裹一个Fe3O4磁性纳米粒子的氨基磁珠呈球体，形状规则，包裹两个以上Fe3O4的氨基磁珠的形状呈不定形态；所述的纳米氨基磁珠按照如下步骤制备得到：(a)裸Fe3O4磁性纳米粒子的合成：在氮气的保护下取15mL0.8mol/L的FeCl3与10mL0.8mol/L的FeSO4·7H2O加入300mL去氧水，进行搅拌，加入50mLlmol/L的氢氧化钠，反应30min后，升温至67℃，陈化30min，将反应液冷却至室温，用去氧水将沉淀洗至中性，在旋转磁力架上进行磁性分离，制成裸Fe3O4磁性纳米粒子；(b)二氧化硅包裹的Fe3O4磁性纳米粒子的合成：取270mg的Fe3O4磁性纳米粒子于8.5mL去氧水中，涡旋2min，第一次超声处理10min；量取116mL环己烷，26mL正己醇，30mLTritonX-100组成油包水的微乳液，涡旋并进行第二次超声处理10min；然后将Fe3O4磁性纳米粒子分散溶液加入反相微乳液中，继续涡旋并第三次超声处理20min，室温下静置24h，去除沉淀，得到二氧化硅包裹的Fe3O4磁性纳米粒子；(c)氨基修饰的硅包Fe3O4磁性纳米粒子的合成：将得到的微乳液体系稍作第四次超声处理5min后转至室温搅拌，30min后逐滴滴加1.2mL正硅酸乙酯，继续搅拌30min后滴加2.5mL25％氨水，接着搅拌48h，加入20mL丙酮，在5000r/min...

【专利技术属性】
技术研发人员：栗绍文，孙梦真，孟宪荣，王雪，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42