一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法技术

本发明专利技术提供了一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法，采集的组织在活化基底的包围下可以有效地进行贴壁生长，血清成分可抑制肺泡上皮细胞的分裂和分化，从而大大提高了细胞活力；组织碎片在特定的气体环境下震荡培养，可以有效避免采集的组织样本由于缺血而引起损伤，以利于后续的培养操作；传代培养基中添加的尿囊素、肌酸和积雪草苷可以有效提高细胞活力和分裂能力，从而促进细胞生长和增殖；将3T3细胞作为滋养层，可以为原代肺泡上皮细胞提供良好的生长基底，有效促进肺泡上皮细胞的生长分裂，从而大大提高培养效果。通过上述方法，可以显著提高肺泡上皮细胞的活性和增值速率，从而为相关研究项目提供优质的实验材料。

A Method for Isolation and Culture of Human Alveolar Epithelial Cells

The present invention provides a method for isolation and culture of human alveolar epithelial cells. The collected tissues can effectively adhere to the wall under the surroundings of activated basement, and the serum components can inhibit the division and differentiation of alveolar epithelial cells, thus greatly improving the cell viability. Tissue fragments can be cultured in a specific gas environment by oscillation, thus effectively avoiding the ischemia of the collected tissue samples. The addition of allantoin, creatine and asiaticoside in the subculture medium can effectively improve cell viability and division ability, thus promoting cell growth and proliferation; 3T3 cells as trophoblast can provide a good growth base for primary alveolar epithelial cells, effectively promote the growth and division of alveolar epithelial cells, thus greatly promoting the growth and division of alveolar epithelial cells. Improve the effect of culture. These methods can significantly improve the activity and growth rate of alveolar epithelial cells, thus providing high quality experimental materials for related research projects.

【技术实现步骤摘要】
一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法
本专利技术属于组织工程
，特别涉及一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法。
技术介绍
气道上皮细胞是功能活跃的细胞，不仅构成呼吸道的物理屏障，还具有对化学性毒物或药物的转化代谢作用，具有自分泌或旁分泌功能，同时参与对毗邻细胞功能的调控。刚离体的原代细胞保留有原有的生物学遗传特性，能反映体内细胞生长的一般特征，因此适用于药物及疗法等研究。建立正常肺泡上皮细胞及病变的肺泡上皮细胞的体外细胞模型，有利于更好地了解肺泡上皮细胞的病理改变，较动物实验而言也更为简便、可靠。但目前对肺泡上皮细胞的体外培养尚不成熟。因此，探索一种能提高肺泡上皮细胞活性和增殖能力的体外培养方法，已成为本领域技术人员急需解决的技术问题。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术提供了一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法，包括如下步骤：S1：在无菌条件下采集肺叶样本，将气管切成片状组织，得到肺泡上皮组织的组织碎片；S2：配置用于细胞贴壁生长的活化基底，涂布在培养皿上并进行固化；S3：在固化的所述活化基底上设置接种位置，并将所述组织碎片接种到所述接种位置上，使所述组织碎块贴附在培养皿底壁；S4：向接种后的组织碎片中添加活化培养液，置于混合氧气内进行活化培养；该步骤可以有效避免采集的组织样本由于缺血而引起损伤，以利于后续的培养操作；S5：将经过活化培养的组织碎片转移到新的涂布有活化基底的培养皿中，添加原代培养液，在CO2培养箱中进行原代培养，培养8～10d后将组织碎片转移至新的涂布有活化基底的培养皿中，重复原代培养过程若干次，得到原代细胞；S6：将所述原代细胞以每瓶104个细胞的浓度进行接种，采用经过照射的3T3细胞作滋养层，加入传代培养液进行悬浮培养，得到传代细胞；将3T3细胞作为滋养层，可以为原代肺泡上皮细胞提供良好的生长基底；将原代肺泡上皮细胞接种于其上之后，肺泡上皮细胞能明显抑制3T3细胞的生长，且自身生长良好，并将3T3细胞不断推至培养皿边缘。通过上述方法，可以有效促进肺泡上皮细胞的生长分裂，从而大大提高培养效果。进一步地，步骤S1的具体方法如下：在无菌条件下采集肺叶样本，浸入L-15培养液中，切开气管，并切成1cm2的正方形片状，得到肺泡上皮组织的组织碎片。进一步地，步骤S2的具体方法如下：配置用于细胞贴壁生长的活化基底，取1ml涂布在6cm培养皿底面，置于36.5℃的CO2培养箱内放置2h，使所述活化基底固化，并加入5ml活化培养液。进一步地，步骤S3的具体方法如下：在培养皿底部表面边缘用解剖刀刻画出1cm2的正方形，并去除其中的活化基底，形成接种位置；将所述组织碎片上皮面向上移入所述接种位置中，去除活化培养液，在室温下静置3～5min，使组织块贴附在培养皿底壁。进一步地，步骤S4的具体方法如下：向接种后的组织碎片中添加3mlDMEM培养液，放入可控气室，向气室中注入混合氧气，将气室置于摇床上，在36.5℃、10r/min条件下培养24h，使培养液从组织碎片表面流过、充分浸润组织碎片；然后更换DMEM培养液和混合氧气，继续培养6～8d，每2d更换一次培养液和混合氧气；所述混合氧气包括50％O2、45％N2以及5％CO2。上述混合氧气可以有效避免采集的组织样本由于缺血而引起损伤，以利于后续的培养操作。进一步地，步骤S5的具体方法如下：S5.1：用新的10cm培养皿凸部活化基底，并对活化基底底部进行真空吸引，用解剖刀刻画新的接种位置，并将组织碎片转移至新的培养基中，添加无菌培养液，室温下放置3～5h；S5.2：加入10mlLHC-9培养液(购自ThermoFisher)，在湿化的5％CO2培养箱中进行原代培养，每3～4d更换培养液；S5.3：培养8～10d后，将组织块移入新的涂布有活化基底的培养皿中，重复步骤S5.2若干次，得到原代细胞。进一步地，步骤S6的具体方法如下：S6.1：用PBS缓冲液对所述原代细胞进行洗涤，并用消化液进行消化，消化结束后，用培养液悬浮细胞并计数；按照每瓶104个的接种量接种到新的培养瓶中；S6.2：加入5～10倍数量的经过Co60照射的3T3细胞，混合均匀后加入传代培养液，置于37℃下培养15～30天，即得到传代细胞；3T3细胞的处理方法如下：(1)用含有10％小牛血清的DMEM培养基培养3T3细胞，48h后更换培养液，继续培养15～30天；(2)通过60GyCo60照射、对3T3细胞进行灭活；(3)用所述消化液对灭活的3T3细胞进行消化，用不含血清的DMEM培养基清洗两次，并进行混悬。Co60照射可以使3T3细胞丧失分裂能力，同时不影响原有细胞的活性，从而为原代肺泡细胞提供性质优异的滋养层。进一步地，所述活化基底为添加有如下成分的LHC-9培养液：人纤粘素0.2％；胶原1％；胎牛血清12％。人纤粘素可以促进细胞贴壁生长；胶原可以有效包被细胞、保护细胞；血清可以抑制肺泡上皮细胞的分裂和分化，以保持细胞的形态和活力。上述成分可以提高细胞活力、促进细胞贴壁生长。进一步地，所述消化液为添加有0.02％胰蛋白酶和0.02％EDTA的1％聚乙烯吡咯烷酮溶液。上述成分可以有效地对贴壁的细胞进行消化，从而使细胞充分分散，以利于后续的传代培养。进一步地，所述传代培养液为添加有如下成分的DMEM培养基：乳酸钠格林8～12％、尿囊素1.5～2.5％、肌酸0.5～1％、积雪草苷0.2～0.5％以及绿原酸0.1～0.2％。乳酸钠格林为乳酸钠、氯化钠、氯化钾与氯化钙的灭菌水溶液，可用于提供接近人体的渗透压适中的环境，以利于细胞的存活；尿囊素可以促进细胞生长、软化角质蛋白，从而加快组织更新和伤口愈合；肌酸可以为细胞代谢快速提供能量、促进细胞生长和更新；积雪草苷可以加速细胞代谢和分裂、促进组织生长和伤口愈合；绿原酸具有优异的抗菌、抗病毒效果，并且能有效抗氧化、提升细胞活性。使用上述配比的传代培养液，可以有效提高细胞活力、促进细胞分裂，从而快速获得优质的传代细胞。本专利技术的有益效果如下：本专利技术提供了一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法，采集的组织在活化基底的包围下可以有效地进行贴壁生长，血清成分可抑制肺泡上皮细胞的分裂和分化，从而大大提高了细胞活力；组织碎片在特定的气体环境下震荡培养，可以有效避免采集的组织样本由于缺血而引起损伤，以利于后续的培养操作；传代培养基中添加的尿囊素、肌酸和积雪草苷可以有效提高细胞活力和分裂能力，从而促进细胞生长和增殖；将3T3细胞作为滋养层，可以为原代肺泡上皮细胞提供良好的生长基底，有效促进肺泡上皮细胞的生长分裂，从而大大提高培养效果。通过上述方法，可以显著提高肺泡上皮细胞的活性和增值速率，从而为相关研究项目提供优质的实验材料。附图说明图1为肺泡上皮细胞的电镜照片；图2为采用不同方法对肺泡上皮细胞进行培养的生长曲线。具体实施方式主要试剂及培养基的配制A.L-15培养基：具体成分如下：10％胎牛血清，900mg/LD-半乳糖，300mg/LL-谷氨酰胺，550mg/L丙酮酸钠。B.DMEM培养基：具体成分如下：C.PBS缓冲液：称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：在无菌条件下采集肺叶样本，将气管切成片状组织，得到肺泡上皮组织的组织碎片；S2：配置用于细胞贴壁生长的活化基底，涂布在培养皿上并进行固化；S3：在固化的所述活化基底上设置接种位置，并将所述组织碎片接种到所述接种位置上，使所述组织碎块贴附在培养皿底壁；S4：向接种后的组织碎片中添加活化培养液，置于混合氧气内进行活化培养；S5：将经过活化培养的组织碎片转移到新的涂布有活化基底的培养皿中，添加原代培养液，在CO2培养箱中进行原代培养，培养8～10d后将组织碎片转移至新的涂布有活化基底的培养皿中，重复原代培养过程若干次，得到原代细胞；S6：将所述原代细胞以每瓶10

【技术特征摘要】
1.一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：在无菌条件下采集肺叶样本，将气管切成片状组织，得到肺泡上皮组织的组织碎片；S2：配置用于细胞贴壁生长的活化基底，涂布在培养皿上并进行固化；S3：在固化的所述活化基底上设置接种位置，并将所述组织碎片接种到所述接种位置上，使所述组织碎块贴附在培养皿底壁；S4：向接种后的组织碎片中添加活化培养液，置于混合氧气内进行活化培养；S5：将经过活化培养的组织碎片转移到新的涂布有活化基底的培养皿中，添加原代培养液，在CO2培养箱中进行原代培养，培养8～10d后将组织碎片转移至新的涂布有活化基底的培养皿中，重复原代培养过程若干次，得到原代细胞；S6：将所述原代细胞以每瓶104个细胞的浓度进行接种，采用经过照射的3T3细胞作滋养层，加入传代培养液进行悬浮培养，得到传代细胞。2.如权利要求1所述的人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S1的具体方法如下：在无菌条件下采集肺叶样本，浸入L-15培养液中，切开气管，并切成1cm2的正方形片状，得到肺泡上皮组织的组织碎片。3.如权利要求1所述的人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S2的具体方法如下：配置用于细胞贴壁生长的活化基底，取1ml涂布在6cm培养皿底面，置于36.5℃的CO2培养箱内放置2h，使所述活化基底固化，并加入5ml活化培养液。4.如权利要求1所述的人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S3的具体方法如下：在培养皿底部表面边缘用解剖刀刻画出1cm2的正方形，并去除其中的活化基底，形成接种位置；将所述组织碎片上皮面向上移入所述接种位置中，去除活化培养液，在室温下静置3～5min，使组织块贴附在培养皿底壁。5.如权利要求1所述的人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S4的具体方法如下：向接种后的组织碎片中添加3mlDMEM培养液，放入可控气室，向气室中注入混合氧气，将气室置于摇床上，在36.5℃、10r/min条件下培养24h，然后更换HB培养液和混合氧气，继续培养6～8d，每2d更换一次...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓南，吴芳春，吴刘兵，陈虎，张斌，侍晓云，
申请(专利权)人：北京昱龙摩尔国际生物医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11