一种提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法，包含：步骤1、采用代表性细胞外基质成分生物材料构建适宜打印细胞的生物墨水；步骤2、以生理浓度将适宜皮肤附属器生成的各类蛋白因子与生物墨水混合；步骤3、向步骤2所得的混合液中加入细胞并混匀，选择打印参数后通过3D生物打印机，打印出带有活性皮肤附属器的人工皮肤模型；步骤4、根据皮肤移植部位的个体化需求，调整细胞数量和各类蛋白因子的浓度，以及打印参数，并在打印后将所得的3D人工皮肤模型置于适宜不同附属器生长的培养条件下继续培养。本发明专利技术提供的方法，能够提高人工皮肤的仿真性和生物功能性，可以更好地应用于皮肤缺损创面的移植。

A Method for Improving the Activity and Controlling the Distribution of Appendices in Artificial Skin

The invention discloses a method for improving the activity of appendages in artificial skin and controlling their distribution, which includes: step 1, constructing bio-ink suitable for printing cells by using representative extracellular matrix biomaterials; step 2, mixing various protein factors suitable for skin appendages with bio-ink at physiological concentration; step 3, adding fineness to the mixture obtained in step 2. After choosing the printing parameters, the artificial skin model with active skin appendages was printed by 3D bioprinter. Step 4: According to the individual needs of the skin transplantation site, adjust the number of cells and the concentration of various protein factors, as well as the printing parameters. After printing, the 3D artificial skin model was placed in the culture conditions suitable for the growth of different appendages. Continue to cultivate. The method provided by the invention can improve the simulation and biological function of artificial skin, and can be better applied to the transplantation of skin defect wounds.

【技术实现步骤摘要】
一种提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法
本专利技术涉及一种医疗模型制造及应用领域的方法，具体地，涉及一种利用生物3D打印技术提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法。
技术介绍
目前，用于治疗皮肤损伤最通常的方法是手术移植其他部位的皮肤到损伤部位，其最大的局限是正常皮肤的来源有限，难以满足大面积损伤治疗需求。利用体外培养扩增的细胞，结合框架蛋白形成组织工程皮肤或人皮肤的替代品，虽然在一定程度上具有取代同种异体皮肤移植的应用价值，但是其真正的应用与临床要求还有较大的差距。因此，如何提高工程化皮肤的仿真性和生物学性能以提高远期疗效等都是目前临床亟待解决的重要问题。理想的人工皮肤应具备良好的生物相容性和生物降解性，植入体内后的降解和吸收速度应与细胞和(或)组织生长的速度相匹配，具有足够的力学强度、高孔隙率、高表面积，便于细胞的粘附和进入以及物质交换等。目前大部分研究表明，以动物胶原和糖胺多糖等为主要成分的海绵状真皮支架的工程化皮肤，虽能基本满足上述要求，但这些材料均不含皮肤附件，在移植后均无皮肤附属器官形成，从功能上来讲他们仅仅是敷料，还不是理想的工程化皮肤。这是目前工程化皮肤发展亟待攻克的科学问题和技术难题之一。之所以缺乏皮肤附件，主要是在以往工程化皮肤设计时没有考虑这方面需求，因此缺乏相关理论与关键技术。同时，已有研究表明，微环境在器官与组织再生过程中发挥重要作用，而皮肤及其附属器的形成也极易受到微环境的影响。因此，体外构建适宜皮肤再生的微环境是提高工程化皮肤的仿真性和生物学性能以提高远期疗效的一种有效手段。然而微环境具有复杂多向性，体外构建需克服诸多障碍。因此，新一代工程化皮肤的设计理念是：应具有与天然皮肤一致的皮肤附件并且活性及分布均能满足其功能需求。要达到这样的精准设计，需要借助生物3D打印技术才能得以完成。同时，要实现移植后的皮肤全功能再生，具有皮肤附属器特化潜能的细胞和适宜的微环境二者缺一不可，生物3D打印技术也可确保细胞和微环境的同时接入等关键技术的实现。生物3D打印技术通过3D生物打印机(3Dbio-printer；3Dbiologyprinter)来完成。3D生物打印机是一种能够在数字三维模型驱动下，按照增材制造原理定位装配生物材料或细胞单元，制造医疗器械、组织工程支架和组织器官等制品的装备。这种机器首先读入由医学影像数据重建或设计的三维模型，将模型离散成多个片层，计算机控制打印喷头逐层″打印”打印由生物材料或细胞组成的“生物墨水”，不断重复这一过程，直至打印完成三维组织前体。随后，细胞开始重新组织、熔合，形成新的血管等组织结构。生物打印机不是利用一层层的塑料，而是利用一层层的生物材料或者细胞构造块，去制造真正的活体组织。3D生物打印机可以有多个打印喷头，喷头可以打印人体细胞，被称为“生物墨”；也可以打印纯生物材料，被称为“生物纸”。所谓生物纸其实是主要成分是水凝胶，可用作细胞生长的支架。3D生物打印机使用来自患者自己身体的细胞，所以不会产生排异反应。3D生物打印时，首先在生物打印前，需要先计划细胞支架的结构并选择打印中会使用到的材质。开始打印前，要先取得患者器官的组织检体和医学影像。使用电脑断层和核磁共振取得患者的医学影像，是最常见的方法。取得影像后，利用软件将平面的医学影像重建出立体结构，并分离出预计要培养的细胞并加以增量后，便完成打印前的准备。这些细胞将和液态的特殊生物材质，在细胞混合器中混合。这种特殊生物材质能提供细胞生存所需的氧气与其他营养物质。在某些特殊情况，细胞甚至会被放入直径500微米的小球中，被保护起来。混入液体凝胶中的细胞并不需要细胞支架即可生存。这些细胞和营养基质的混合物将被放入管状的容器中，在打印的过程被挤压出来，以形成组织的形状。生物打印的接下来的步骤，将应用到生物墨水。生物墨水指的就是细胞与维生物质混合的液体基质。在这一步骤中，生物墨水将被放在生物打印机的墨水匣中，依照患者的医学影像资料，依序打印。生物打印所制造出来的初始组织物，将被送入细胞培养器中，慢慢地将充满细胞的初始组织培育成真正的组织。生物打印常常会需要将细胞平均散布到生物相容的支架上，这些生物相容的支架由积层制造法制造而成，最终形成了立体的组织似的架构。生物打印所制造的人工肝脏与人工肾脏，目前仍旧缺乏像是血管或是肾小管等的功能性单位，而且非常难以培育成多细胞的完整器官。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效精准的、可提高人工皮肤仿真性和功能性的制备人工皮肤的技术方法，能够解决人工皮肤移植后的皮肤功能性附属器的活性及分布控制等技术问题。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法，其中，所述的方法包含：步骤1、采用代表性细胞外基质成分生物材料构建适宜打印细胞的生物墨水；生物墨水指的就是细胞与维生物质即代表性细胞外基质成分生物材料混合而成的液体基质。步骤2、以生理浓度将适宜皮肤附属器生成的各类蛋白因子与生物墨水混合；步骤3、向步骤2所得的混合液中加入细胞并混匀，选择打印参数后通过3D生物打印机，打印出带有活性皮肤附属器的人工皮肤模型；步骤4、根据皮肤移植部位的个体化需求，如某些部位需承载出汗功能，有些部位需要毛发等特征，在打印过程中调整细胞数量和各类蛋白因子的浓度等，以及打印参数，可根据皮肤附属器的不同种类做适当调整，选择最佳的构建参数；并在打印后将所得的3D人工皮肤模型置于适宜不同附属器生长的培养条件下继续培养。上述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法，其中，所述细胞包含皮肤附属器细胞、个性化定制所需皮肤细胞，或者可以诱导皮肤附属器生成的成体干细胞；所述的个性化定制所需皮肤细胞包含汗腺细胞、毛囊细胞、皮脂腺细胞、表皮细胞、真皮成纤维细胞、脂肪细胞，以及黑色素细胞等；所述的可以诱导皮肤附属器生成的成体干细胞包含间充质干细胞、表皮干细胞、毛囊干细胞，以及真皮干细胞等。皮肤附属器是胚胎发生中由表皮衍生而来，包括毛、皮脂腺、汗腺、指(趾)甲等。皮肤附属器对维持正常的皮肤功能具有重要作用。上述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法，其中，所述的代表性细胞外基质成分生物材料包含明胶、壳聚糖、透明质酸、胶原、水凝胶、海藻酸钠，以及合成性生物材料PLGA(polylactic-co-glycolicacid，聚乳酸-羟基乙酸共聚物)等中的任意一种或多种的混合物。上述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法，其中，所述的各类蛋白因子是包含Cthrc1、EGF、BMP4、BMP5、bFGF、VEGF等的诱导蛋白因子、生长因子以及各种趋化因子。上述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法，其中，所述的打印参数包含交联温度和时间，交联溶剂浓度，打印速度以及压力。上述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法，其中，所述的步骤3包含：步骤3.1、将配置好的混合有各类蛋白因子的存储于4℃的生物墨水取出，在37℃充分溶解，将1ml细胞悬液加入20ml生物墨水中，缓慢上下颠倒混匀，动作轻柔，防止混入太多小气泡；步骤3.2、将混匀的生物墨水移入3D生物打印机的打印筒，旋紧打印嘴活塞，使用封口膜封口；步骤3.3、将打印筒放入10℃水中静置，待生物墨水转变为胶状时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法，其特征在于，所述的方法包含：步骤1、采用代表性细胞外基质成分生物材料构建适宜打印细胞的生物墨水；步骤2、以生理浓度将适宜皮肤附属器生成的各类蛋白因子与生物墨水混合；步骤3、向步骤2所得的混合液中加入细胞并混匀，选择打印参数后通过3D生物打印机，打印出带有活性皮肤附属器的人工皮肤模型；步骤4、根据皮肤移植部位的个体化需求，调整细胞数量和各类蛋白因子的浓度，以及打印参数，并在打印后将所得的3D人工皮肤模型置于适宜不同附属器生长的培养条件下继续培养。

【技术特征摘要】
1.一种提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法，其特征在于，所述的方法包含：步骤1、采用代表性细胞外基质成分生物材料构建适宜打印细胞的生物墨水；步骤2、以生理浓度将适宜皮肤附属器生成的各类蛋白因子与生物墨水混合；步骤3、向步骤2所得的混合液中加入细胞并混匀，选择打印参数后通过3D生物打印机，打印出带有活性皮肤附属器的人工皮肤模型；步骤4、根据皮肤移植部位的个体化需求，调整细胞数量和各类蛋白因子的浓度，以及打印参数，并在打印后将所得的3D人工皮肤模型置于适宜不同附属器生长的培养条件下继续培养。2.如权利要求1所述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法，其特征在于，所述细胞包含皮肤附属器细胞、个性化定制所需皮肤细胞，或者可以诱导皮肤附属器生成的成体干细胞；所述的个性化定制所需皮肤细胞包含汗腺细胞、毛囊细胞、皮脂腺细胞、表皮细胞、真皮成纤维细胞、脂肪细胞，以及黑色素细胞；所述的可以诱导皮肤附属器生成的成体干细胞包含间充质干细胞、表皮干细胞、毛囊干细胞，以及真皮干细胞。3.如权利要求1所述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法，其特征在于，所述的代表性细胞外基质成分生物材料包含明胶、壳聚糖、透明质酸、胶原、水凝胶、海藻酸钠，以及合成性生物材料PLGA中的任意一种或多种的混合物。4.如权利要求1所述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法，其特征在于，所述的各类蛋白因子是包含Cthrc1、EGF、BMP4、BMP5、bFGF、VEGF的诱导蛋白因子、生长因子以及趋化因子。5.如权利要求1所述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法，其特征在于，所述的打印参数包含交联温度和时间，交联...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄沙，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京,11