一种福氏紫薇组培再生体系建立的方法技术

本发明专利技术涉及一种福氏紫薇组培再生体系建立的方法，该方法利用福氏紫薇种子萌发获得无菌实生苗，然后剪取幼嫩叶片为外植体，通过对外植体进行脱分化培养，获得再分化能力强的愈伤组织，进而利用愈伤组织进行再分化培养和后续的生根培养实现再生植株。本发明专利技术利用无菌实生苗为外植体，避免了传统的外植体由于分化程度高而脱分化不易和污染率高的问题，操作简单、可行。具体包括以下几个步骤：1.实生无菌苗的获得；2.愈伤组织的诱导；3.愈伤组织的继代和增殖；4.愈伤组织的再分化；5.生根培养；6.植株再生。本发明专利技术中褔氏紫薇的愈伤增殖倍数达2.1倍，组培再生率达到95%以上，为紫薇遗传转化体系的建立奠定了坚实的实验基础。

A Method for Establishing Tissue Culture Regeneration System of Lagerstroemia forsythii

The invention relates to a method for establishing tissue culture and regeneration system of Lagerstroemia forsythii. The method uses seeds of Lagerstroemia forsythii to germinate to obtain sterile seedlings, and then cuts young leaves as explants. Through dedifferentiation culture of explants, callus with strong redifferentiation ability can be obtained, and then regeneration plants can be realized through callus redifferentiation culture and subsequent rooting culture. By using sterile seedlings as explants, the invention avoids the problems of difficult dedifferentiation and high pollution rate caused by high differentiation degree of traditional explants, and is simple and feasible in operation. It includes the following steps: 1. acquisition of seedlings; 2. induction of callus; 3. subculture and proliferation of callus; 4. redifferentiation of callus; 5. rooting culture; 6. plant regeneration. The callus multiplication multiple of Lagerstroemia crassipes is 2.1 times and the regeneration rate of tissue culture is over 95%, which lays a solid experimental foundation for the establishment of genetic transformation system of Lagerstroemia crassipes.

【技术实现步骤摘要】
一种福氏紫薇组培再生体系建立的方法
本专利技术涉及一种福氏紫薇组培再生体系建立的方法，属于木本植物组织培养

技术介绍
紫薇（Lagerstroemiaindica）属于千屈菜科（Lythraceae）紫薇属，别名“百日红”、“满堂红”。紫薇原产中国，是我国传统名花之一。国内应用的主要有大花紫薇（L.speciosa）、福建紫薇（L.limii）、南紫薇（L.subcostata）等，国外广泛栽培的也只有大花紫薇和紫薇两个种。紫薇通常用作落叶灌木或乔木栽植，由于紫薇树干光滑，树姿优美，适应性强，常作为行道树、街景树栽培，有些城市以紫薇作为市花（树）。在育种方面，美国育种学家从1962年开始进行紫薇的育种研究，通过种内、种间杂交育种，选育出抗白粉病且花色红艳的品种，日本Takii种苗株式会社利用从我国引进的紫薇资源，选育出矮生多花品种。近年来，我国也开始充分利用国内丰富的紫薇资源进行杂交育种及相关的研究，有望选育出一批有观赏价值的新品种，从而更好的丰富紫薇园林应用品种。由于传统的遗传育种具有较大的盲目性，选育周期长等缺点，而现代的细胞工程育种和分子育种等手段克服了这些缺点。近年来，木本植物组织培养研究获得了很大进展，如杨树、梅花、桉树、悬铃木等，其再生可通过体细胞胚发生途径或器官发生途径来完成，但对于木本植物，从营养器官诱导体细胞胚非常困难。通过组织培养的方法使植株再生是对植物进行转基因改良的重要前提条件，目前绝大多数的遗传转化体系都需要建立一个稳定的植株再生体系来进行基因的转移、转化植株的选择和再生，包括直接或间接的再生体系已被广泛用于植株遗传改良。
技术实现思路
为给紫薇遗传转化奠定基础，本专利技术提供一种福氏紫薇（大红花紫薇：LagerstroemiaבTuscarora’）组培再生体系建立的方法。为达到上述目的，本专利技术提供了一种福氏紫薇组培再生体系的方法，具体步骤如下所述：本专利技术提供了一种福氏紫薇组培再生体系的方法，具体步骤如下所述：1）实生无菌苗的获得采收褔氏紫薇健康母树上发育良好的种子，人工去掉种翅并防止损伤种皮，进行消毒：先用自来水冲洗30min，然后75％乙醇处理30s；1%次氯酸钠灭菌15min，然后无菌水冲洗5次，消毒后播种于MS基本培养基中，获得生长健壮的实生苗；2）愈伤组织的诱导剪取步骤（1）中无菌培养20天的叶片，垂直叶片主脉剪3～4下，保持一侧叶缘相连，叶片正面朝上接种于愈伤诱导培养基1/2MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D1.0+蔗糖30g/L+琼脂7g/L中，暗培养处理7天，培养温度25℃左右，光照强度2000-3000lx，光照时间14h/d；3）愈伤组织的继代和增殖将步骤（2）中获得的愈伤组织切成直径约6-10mm接种于普通B5培养基，每瓶培养基接愈伤组织5-10块，暗培养，培养温度为23-27℃,每20天继代一次，培养20天，得到愈伤组织鲜重可以增殖为原来的2.1倍；4）愈伤组织的分化将步骤（3）中获得的愈伤组织接种于分化培养基WPM+6-BA1.0+IBA0.2+Vc100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L中进行再分化诱导，每瓶接种2块愈伤组织，每处理分别接种15瓶，，培养温度为25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间14h/d；5）生根培养将步骤（4）中获得的含有不定芽的无根试管苗接种于生根培养基改良1/2M+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L中进行生根培养15-20天，培养温度为23±3℃，光照时间为14h/d，光照强度为1500-2000lx；6）无菌苗的炼苗将步骤（5）中获得的福氏紫薇带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，室内培养5-7天，然后移栽于采用多菌灵消毒的基质中，使用带孔PVC膜覆盖保湿，放在通风阴凉处培养25-30天，培养到第15天将PVC膜移除，换用遮光率75%-80%的遮阳网，栽培所用基质成分为体积比1：1的泥炭土与珍珠岩。本专利技术大红花紫薇组培再生体系建立的方法具有以下优点：1）该再生体系具有高愈伤组织诱导率、简单增殖方式，遗传稳定等特点，可以为成为遗传转化的对象。因此，本技术为福氏紫薇遗传转化体系的建立奠定基础；2）采用无菌的种子苗的叶片进行愈伤组织诱导，再生能力强且不易污染。再生率达到95%以上。具体实施方式本专利技术提供了一种福氏紫薇组培再生体系的方法，具体步骤如下所述：1）实生无菌苗的获得采收褔氏紫薇健康母树上发育良好的种子，人工去掉种翅并防止损伤种皮，进行消毒：先用自来水冲洗30min，然后75％乙醇处理30s；1%次氯酸钠灭菌15min，然后无菌水冲洗5次，消毒后播种于MS基本培养基中，获得生长健壮的实生苗；2）愈伤组织的诱导剪取步骤（1）中无菌培养20天的叶片，垂直叶片主脉剪3～4下，保持一侧叶缘相连，叶片正面朝上接种于愈伤诱导培养基1/2MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D1.0+蔗糖30g/L+琼脂7g/L中，暗培养处理7天，培养温度25℃左右，光照强度2000-3000lx，光照时间14h/d；3）愈伤组织的继代和增殖将步骤（2）中获得的愈伤组织切成直径约6-10mm接种于普通B5培养基，每瓶培养基接愈伤组织5-10块，暗培养，培养温度为23-27℃,每20天继代一次，培养20天，得到愈伤组织鲜重可以增殖为原来的2.1倍；4）愈伤组织的分化将步骤（3）中获得的愈伤组织接种于分化培养基WPM+6-BA1.0+IBA0.2+Vc100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L中进行再分化诱导，每瓶接种2块愈伤组织，每处理分别接种15瓶，培养温度为25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间14h/d，愈伤分化率达95.7%；5）生根培养将步骤（4）中获得的含有不定芽的无根试管苗接种于生根培养基改良1/2M+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L中进行生根培养15-20天，培养温度为23±3℃，光照时间为14h/d，光照强度为1500-2000lx；6）无菌苗的炼苗将步骤（5）中获得的福氏紫薇带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，室内培养5-7天，然后移栽于采用多菌灵消毒的基质中，使用带孔PVC膜覆盖保湿，放在通风阴凉处培养25-30天，培养到第15天将PVC膜移除，换用遮光率75%-80%的遮阳网，栽培所用基质成分为体积比1：1的泥炭土与珍珠岩。根长1-2cm、苗高3-4cm的组培苗经室内炼苗7天后移栽，成活率达90%。上述诱导培养基，继代增殖培养基，生根培养基中均含有琼脂9.0g/L，蔗糖30g/L,PH值为：5.8-6.0。采用上述方法进行大红花紫薇（LagerstroemiaבTuscarora’）组培再生体系建立，成功获得含根组培种苗，紫薇遗传转化体系的建立奠定了坚实的实验基础。以上虽然已以较佳实施例公开了本专利技术，然其并非用以限制本专利技术，凡采用等同替换或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.本专利技术提供了一种福氏紫薇组培再生体系的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：实生无菌苗的获得采收褔氏紫薇健康母树上发育良好的种子，人工去掉种翅并防止损伤种皮，进行消毒：

【技术特征摘要】
1.本发明提供了一种福氏紫薇组培再生体系的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：实生无菌苗的获得采收褔氏紫薇健康母树上发育良好的种子，人工去掉种翅并防止损伤种皮，进行消毒：先用自来水冲洗30min，然后75％乙醇处理30s；1%次氯酸钠灭菌15min，然后无菌水冲洗5次，消毒后播种于MS基本培养基中，获得生长健壮的实生苗；愈伤组织的诱导剪取步骤（1）中无菌培养20天的叶片，垂直叶片主脉剪3～4下，保持一侧叶缘相连，叶片正面朝上接种于愈伤诱导培养基中，暗培养处理7天，培养温度25℃左右，光照强度2000-3000lx，光照时间14h/d；愈伤组织的继代和增殖将步骤（2）中获得的愈伤组织切成直径约6-10mm接种于普通B5培养基，每瓶培养基接愈伤组织5-10块，暗培养，培养温度为23-27℃,每20天继代一次，培养20天，得到愈伤组织鲜重可以增殖为原来的2.1倍；愈伤组织的分化将步骤（3）中获得的愈伤组织接种于分化培养基中进行再分化诱导，每瓶接种2块愈伤组织，每处理分别接种15瓶，培养温度为25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间14h/d；（5）生根培养将步骤（4）中获得的含有不定芽的无根试管苗接种于生根培养基中进行生根培养15-20天，培养温度为23±3℃，光照时间为14h/d，光照强度为1500-2000lx；（6）无菌苗的炼苗将步...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红，吴寒，陆小清，李乃伟，周艳威，张凡，李云龙，王传永，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32