一株生物催化合成(R)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一株生物催化合成(R)‑1,3‑丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用，属于生物催化技术领域。生物催化合成(R)‑1,3‑丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011，Bacillus velezensis，保藏编号为CGMCC No.13354。所述菌株是一种能够以4‑羟基‑2‑丁酮为底物催化合成(R)‑1,3‑丁二醇的新菌株，该菌株能够表达产生羰基还原酶，通过该菌株能够实现(R)‑1,3‑丁二醇高纯度的制备，其转化率95％，光学纯度达到100％。使用本发明专利技术的菌株进行不对称还原工艺，反应条件温和，节能环保，同时显著提高(R)‑1,3‑丁二醇的经济效益，具有很好的工业应用前景。

A Bacillus Beles strain for biocatalytic synthesis of (R) -1,3-butanediol and its application

The invention provides a Bacillus beliae strain for biocatalytic synthesis (R) 1,3-butanediol and its application, which belongs to the field of biocatalytic technology. Bacillus beliae strain SWGC31011, Bacillus velezensis, biocatalytic synthesis (R) 1,3_butanediol, preservation number CGMCC No. 13354. The strain is a new strain which can catalyze the synthesis of (R) 1,3 butanediol with 4 hydroxy 2 butanone as substrate. The strain can express carbonyl reductase, and through the strain can achieve the preparation of (R) 1,3 butanediol with high purity, the conversion rate is 95%, and the optical purity is 100%. The asymmetric reduction process by using the strain of the invention has mild reaction conditions, energy saving and environmental protection, and remarkably improves the economic benefit of (R) 1,3 butanediol, which has good industrial application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一株生物催化合成(R)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用
本专利技术属于生物催化
，具体涉及一株生物催化合成(R)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用。
技术介绍
(R)-1,3-丁二醇(1,3-BDO)，是一种无色、无味、低毒的粘稠液体，其结构如下所示，其熔点较高，为207.5℃，在常压下蒸馏容易被空气氧化，常在减压下进行蒸馏。(R)-1,3-丁二醇无臭味，略有苦味，吸水性较强。(R)-1,3-丁二醇是一种重要的手性合成中间物，被广泛地用于碳青霉烯类抗生素母核氮杂环丁酮、香料、信息激素和杀虫剂等物质的合成，具体如图1所示。在这些化合物中，碳青霉烯类药物、青霉烯类药物和青霉素都同属于β-内酰胺类抗生素，而青霉素的滥用导致许多抗药性菌株产生，但碳青霉烯类药物能够有效地缓解这些抗药性菌株引起的症状，碳青霉烯类药物在国内被广泛的应用，因此，开发绿色、高效的(R)-1,3-丁二醇合成技术成为国内外重要研究的目的。目前，(R)-1,3-丁二醇主要是采用化学合成方法获得，化学合成法是以L-苏氨酸为起始原料，其反应过程经过亚硝化脱氨、甲酯化、氢解脱钙和还原等步骤，得到粗品，再重结晶而得到纯品，其工艺原料成本非常高，毒害较大，反应步骤多、反应过程复杂、副反应多且易造成环境污染，(R)-1,3-丁二醇的收率仅仅为64％，化学抽提不仅效率低，而且大量有机溶剂的使用也造成安全上的隐患和环境的污染。另一种化学合成的方法是以钌基催化剂催化4-羟基-2-丁酮不对称加氢还原技术合成(R)-1,3-丁二醇，该方法其收率达到99％以上，但催化剂制备成本高，无法实现工业化规模生产。而生物催化法以其环境友好、反应条件温和、对底物专一等优点逐渐成为了(R)-1,3-丁二醇制备最具前景的研究方向。国内外关于生物催化方法合成(R)-1,3-丁二醇的相关报道很少。1993年，Eguchi等利用固定化SP382脂肪酶重复催化双酰基化反应拆分(R,S)-1,3-丁二醇工艺制备(R)-1,3-丁二醇，其光学纯度达98％以上，但其收率较低(TamotsuEguchi,KenichiMochida.Lipase-catalyzeddiacylationof1,3-butanediol[J].Biotechnol.Lett.,1993,15(9):955-960.)。AkinobuMatsuyama等多次报道了利用不同酵母催化合成(R)-1,3-丁二醇，其中在1993年他们报道了利用乳酸克鲁维酵母KluvermyceslactisIFO1267不对称还原前手性4-羟基-2-丁酮制备(R)-1,3-丁二醇，其得率达到99％，光学纯度达到93％；同样在2001年报道了利用近平滑假丝酵母CandiaparapsilosisIFO1396拆分外消旋体制备(R)-1,3-丁二醇，其光学纯度达到94％，得率达到48％，但这两种反应的立体选择性较低，很难满足药物的合成需求((1)AMatsuyama，HYamamoto，NKawada，YKobayashi.Industrialproductionof(R)-1,3-butanediolbynewbiocatalysts.JournalofMolecularCatalysisBEnzymatic,2001,11(4):513-521.(2)MatsuyamaA，KobayashiY，OhnishiH.MicrobialProductionofOpticallyActive1,3-Butanediolfrom4-Hydroxy-2-butanone.JournaloftheAgriculturalChemicalSociety,1993,57(4):685-686.)。2011年邱照宽等利用土样筛选到一株能够高效催化4-羟基-2-丁酮合成(R)-1,3-丁二醇的克鲁斯假丝酵母09162。其合成途径是该菌株利用本身表达的羰基还原酶催化还原4-羟基-2-丁酮合成(R)-1,3-丁二醇，产物光学纯度达到99％，转化效率为90％(邱照宽等.2011,37(7):17-21.)。研究表明，在生物催化4-羟基-2-丁酮合成(R)-1,3-丁二醇的过程中，需要耦合专一配对的还原酶对其进行供氢研究并消耗大量辅酶NADH，耦合辅酶循环用酶对其整个催化体系要求更高，因而少有能直接应用于工业化生产的生物催化法研究，同时在以前报道的生物催化合成(R)-1,3-丁二醇都是在真核生物中进行，还没有关于原核生物催化合成(R)-1,3-丁二醇的报道。因此，开发一些新型、高效、稳定并可以应用于工业化生产专一的羰基还原酶，进一步优化反应条件，获得最佳(R)-1,3-丁二醇转化率，对于工业制备(R)-1,3-丁二醇具有重要的研究意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种能够表达羰基还原酶的原核细菌菌株，所述原核细菌菌株利用所表达的羰基还原酶高效立体选择性地催化4-羟基-2-丁酮合成(R)-1,3-丁二醇。本专利技术提供的一株生物催化合成(R)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011，Bacillusvelezensis，保藏编号为CGMCCNo.13354。本专利技术提供了一种所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011的培养方法，包括以下步骤：1)将贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011接种至种子培养基中，在28～30℃下培养8～10h，得到贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌种；2)将步骤1)中得到贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌种接种至发酵培养基，在28～30℃、150～300rpm下培养24～36h，得到发酵液固液分离，收集含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体。优选的，所述种子培养基为LB培养基；所述发酵培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖10～45g/L、酵母膏10～50g/L、MgSO40.2～1.5g/L、(NH4)2HPO40.5～3.5g/L和KH2PO40.5～3.5g/L，溶剂为水，pH值为5.5～8.5。优选的，所述步骤1)或步骤2)中接种的接种量独立为0.1％～10％。优选的，所述收集含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体的方法是将固液分离后得到的固相经生理盐水洗涤后，得到菌体；固液分离的方法为离心；所述离心的转速为7000～9000rpm，所述离心的时间为10～20min。本专利技术提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011在合成(R)-1,3-丁二醇中的应用。优选的，所述合成(R)-1,3-丁二醇的方法包括以下步骤：以4-羟基-2-丁酮为底物，以所述培养方法中得到的含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体为催化剂，在20～50℃条件下，pH值6.0～9.0的缓冲液中进行不对称加氢还原反应8～72h，反应结束后反应液经分离纯化得到手性化合物(R)-1,3-丁二醇。优选的，所述缓冲液中底物的初始浓度为5～45g/L。优选的，以湿重计，所述缓冲液中含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体的浓度为10～55g/L。优选的，所述缓冲液包括pH值6.0～7.0的柠檬酸缓冲液或pH值6.5～7.5的磷酸盐缓冲液；所述缓冲液还包括10～本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株生物催化合成(R)‑1,3‑丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011，Bacillus velezensis，保藏编号为CGMCC No.13354。

【技术特征摘要】
1.一株生物催化合成(R)-1,3-丁二醇的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011，Bacillusvelezensis，保藏编号为CGMCCNo.13354。2.一种权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011接种至种子培养基中，在28～30℃下培养8～10h，得到贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌种；2)将步骤1)中所述贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌种接种至发酵培养基，在28～30℃、150～300rpm下培养24～36h，得到的发酵液固液分离，收集含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31011菌体。3.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，所述种子培养基为LB培养基；所述发酵培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖10～45g/L、酵母膏10～50g/L、MgSO40.2～1.5g/L、(NH4)2HPO40.5～3.5g/L和KH2PO40.5～3.5g/L，溶剂为水，pH值为5.5～8.5。4.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，所述步骤1)或步骤2)中接种的接种量独立为0.1％～10％。5.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，所述收集含羰基还原酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SWGC31...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾振华，宋水山，李冉，宋聪，赵芊，黄亚丽，黄媛媛，
申请(专利权)人：河北省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13