一株产葡萄糖氧化酶的海洋细菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供一株能够生产葡萄糖氧化酶的细菌，属于微生物技术领域。该菌株为一种产葡萄糖氧化酶海洋细菌(Citrobacter sp.)8‑Ⅲ菌株，分离自大连地区渤海海域海泥中，该菌株已于2019年1月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏编号为CGMCC NO.17228。本发明专利技术的菌株属于细菌，是一种新的葡萄糖氧化酶生产菌株。此外该菌株所产GOD属于低温酶范畴，可弥补现有GOD低温领域应用空白，因此具有非常好的研发前景。

A Marine Bacteria Producing Glucose Oxidase and Its Application

The invention provides a bacteria capable of producing glucose oxidase, which belongs to the field of microbial technology. The strain is a marine bacteria producing glucose oxidase (Citrobacter sp.) 8 III strain isolated from the mud of Bohai Sea in Dalian area. The strain has been stored in the General Microbial Center of China Microbial Species Preservation and Management Commission on January 24, 2019. Its biological preservation number is CGMCC NO. 17228. The strain of the invention belongs to bacteria and is a new strain for producing glucose oxidase. In addition, the GOD produced by this strain belongs to the category of cryogenic enzymes, which can make up for the gaps in the application of GOD in cryogenic field, so it has a very good research and development prospects.

【技术实现步骤摘要】
一株产葡萄糖氧化酶的海洋细菌及其应用
本专利技术属于微生物
，具体而言，涉及到一种能够生产葡萄糖氧化酶的细菌。
技术介绍
葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase，GOD)，能高度专一性地催化β-D-葡萄糖与空气中的氧反应，使葡萄糖氧化成为葡萄糖酸和过氧化氢，具有去葡萄糖、脱氧、杀菌等作用，而且安全、无毒副作用，在食品的加工保鲜、血糖检测以及饲料加工等方面上都有广泛的应用。现有的GOD菌株来源包括黑曲霉、青霉，其所产GOD适应的作用温度在35℃-50℃，在低温检测、食品保鲜及饲料防腐方面存在着应用弊端。传统GOD来源陆生动物、植物和土壤，不均有低温属性。相关文献报道石漱玉等人从海泥中筛选出产GOD的芽孢杆菌，徐德峰等人从海泥样品中筛选出产GOD的细菌，这些现有技术都充分说明海洋微生物中存在着GOD基因，并且由于海洋生物因其特殊的栖息环境，其产生的酶类具有显著特异性(如耐压、耐碱、耐盐及耐冷等)，其更符合现代生物技术和不同加工产业的应用要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种低温葡萄糖氧化酶菌株，所述菌株所产葡萄糖氧化酶具备低温酶特性。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：一种海洋细菌，一种产葡萄糖氧化酶海洋细菌(Citrobactersp.)8-Ⅲ菌株，该菌株已于2019年1月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCCNO.17228。将该菌株进行16sRNA鉴定，如SEQIDNO.1所示，GenBanK号为MK050005，确定菌株属于为柠檬酸杆菌(Citrobactersp.)。所述的产葡萄糖氧化酶海洋细菌(Citrobactersp.)8-Ⅲ菌株可在制备葡萄糖氧化酶中应用。所述产葡萄糖氧化酶海洋细菌的筛选方法包括以下步骤：步骤1、在无菌操作条件下取大连地区渤海海域的海泥样品，加入装有无菌富集培养基和玻璃珠的三角瓶中，充分摇匀，放入摇床培养箱中20-25℃，160-200r/min培养12-24h，得到样品菌液。富集培养基：酵母提取物0.5-1％，蛋白胨1-3％，氯化钠1-2％。步骤2、将富集后的各样品菌液，用无菌海水稀释到不同梯度，每个梯度取100μL涂布于固体筛选培养基平板上，其置于20-25℃下，倒置培养48-72h，设置平行实验。选取周边培养基出现蓝色显色反应的菌落，继续进行平板划线纯化。固体筛选培养基：葡萄糖4.5-6％，蛋白胨0.27-0.45％，KH2PO40.02-0.04％，(NH4)2HPO40.035-0.05％，CaCO30.3-0.5％，可溶性淀粉0.5-1％，MgSO40.015-0.02％，脱氧胆酸钠0.02-0.03％，氯霉素0.01-0.03％，多氧霉素0.01-0.03％，辣根过氧化物酶0.02-0.04％，邻联茴香胺0.1-0.2％，琼脂粉2-2.5％。步骤3、挑取经过步骤1和2初筛得到的纯化菌株接种于发酵培养基，20-25℃，160-200r/min培养48-72h。然后将菌液于8000r/min离心15min，取上清加入酶活反应体系，在460nm处测量其OD值。每间隔一分钟观察一次，OD值呈现连续上升代表该菌株所产的酶存在酶活。发酵培养基：葡萄糖4-6％，蛋白胨0.3-0.5％，磷酸二氢钾0.2-0.4％，硫酸镁0.05-1％，氯化钾0.05-1％，硝酸钠4-6％，pH7.0。步骤4、将步骤3中离心后的菌在LB固体培养基上观察复筛得到菌落的颜色、形状、光泽、透明程度等形态上的特点；利用电镜观察微生物的形态；20-25℃培养48-72h后进行16sRNA鉴定，如SEQIDNO.1所示，确定菌株属于为柠檬酸杆菌。LB固体培养基：酵母提取物0.5-1％，蛋白胨0.5-1％，氯化钠0.5-1％，琼脂2-2.5％。所述的制备葡萄糖氧化酶方法如下：步骤1、将保藏菌株以2-3％比例接种于LB液体培养基，20-25℃，160-200rpm培养48-72h。LB液体培养基：0.5-1％氯化钠、0.5-1％酵母提取物、0.5-1％蛋白胨；步骤2、取步骤1培养好的菌液200μL接种于100mL发酵培养基，20-25℃，160-200rpm培养48-72h。步骤3、将步骤2所得菌液与饱和硫酸铵溶液混合使硫酸铵饱和度达到75％，0-4℃静置12-16h。步骤4、将步骤3所得菌液8000rpm离心15min，弃上清，以10mLpH7.4的PBS重悬沉淀。步骤5、将重悬液超声裂解15min(开3S，间隔5S，功率200W)。将裂解液10000r/min，4℃，离心20min，上清液为粗酶液。步骤6、粗蛋白经G-100和Ni2+-NTA柱(Novagen)进行亲和层析纯化得到纯化后的葡萄糖氧化酶，洗脱的蛋白液4℃保存。步骤7、将步骤6中得到的纯化后的酶液置于冻干机中冷冻干燥，得到葡萄糖氧化酶酶粉。最后对所产葡萄糖氧化酶的生理生化特征进行检验。本专利技术的有益效果为：本专利技术中筛选出的菌株属于细菌，先前报道的产葡萄糖氧化酶菌株几乎为真菌。细菌相较于真菌基因组更小，更易从基因层面进行研究和改造。该葡萄糖氧化酶最适作用温度在15℃，且在0-20℃相对酶活较高，具备低温酶特性，是其他真菌所不具备的，在低温领域具有较高的研究潜力。附图说明图1为产葡萄糖氧化酶海洋细菌菌落筛选显色图；图2为产葡萄糖氧化酶海洋细菌(Citrobactersp.)8-Ⅲ菌株的电镜形态图；图3为葡萄糖氧化酶最适温度曲线图；图4葡萄糖氧化酶热稳定性曲线图；图5葡萄糖氧化酶最适pH曲线图；图6葡萄糖氧化酶酸碱稳定性曲线图；图7金属离子及螯合剂对酶活力的影响示意图。具体实施方式以下实施例将结合附图对本专利技术作进一步的说明。一、目标菌的筛选步骤1、在无菌操作条件下取大连地区渤海海域的海泥样品4g，加入装有100mL无菌富集培养基和适量玻璃珠的三角瓶中，充分摇匀，放入摇床培养箱中20℃，160r/min培养12h。富集培养基：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％。步骤2、将富集后各样品菌液，用无菌海水稀释到10-6、10-7、10-8三个梯度，每个梯度取100μL涂布于含有辣根过氧化物酶、邻联茴香胺为显色体系的固体筛选培养基平板上，所述初筛平板中氯霉素和多氧霉素抑制真菌生长。25℃恒温倒置培养72h，设置3组平行实验。待菌落直径达到1mm-4mm后，作为被转接种的对象。选取周边培养基出现蓝色显色反应的菌落继续进行平板划线纯化。筛选培养基：葡萄糖4.5％，蛋白胨0.27％，KH2PO40.02％，(NH4)2HPO40.042％，CaCO30.3％，可溶性淀粉0.8％，MgSO40.016％，脱氧胆酸钠0.02％，氯霉素0.01％，多氧霉素0.01％，辣根过氧化物酶0.02％，邻联茴香胺0.12％，琼脂粉2％。步骤3、挑取初筛得到的纯化菌株接种于发酵培养基，25℃，160r/min培养48h。然后将菌液于8000r/min离心15min，取上清加入酶活反应体系，在460nm处测量其OD值。每间隔一分钟观察一次，OD值呈现连续上升代表该菌株所产的酶存在酶活。发酵培养基：葡萄糖6％，蛋白胨0.3％，磷酸二本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产葡萄糖氧化酶海洋细菌(Citrobacter sp.)8‑Ⅲ菌株，该菌株已于2019年1月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCC NO.17228。

【技术特征摘要】
1.一种产葡萄糖氧化酶海洋细菌(Citrobactersp.)8-Ⅲ菌株，该菌株已于2019年1月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCCNO.17228。2.根据权利要求1所述的一种产葡萄糖氧化酶海洋细菌，其特征在于，筛选方法包括以下步骤：步骤1、在无菌操作条件下取大连地区渤海海域的海泥样品，加入装有无菌富集培养基和玻璃珠的三角瓶中，充分摇匀，放入摇床培养箱中20-25℃，160-200r/min培养12-24h，得到样品菌液；步骤2、将富集后的各样品菌液，用无菌海水稀释到不同梯度，每个梯度取100μL涂布于固体筛选培养基平板上，其置于20-25℃下，倒置培养48-72h，设置平行实验；选取周边培养基出现蓝色显色反应的菌落，继续进行平板划线纯化；步骤3、挑取经过步骤1和2初筛得到的纯化菌株接种于发酵培养基，20-25℃，160-200r/min培养48-72h；然后将菌液于8000r/min离心15min，取上清加入酶活反应体系，在460nm处测量其OD值；每间隔一分钟观察一次，OD值呈现连续上升代表该菌株所产的酶存在酶活；步骤4、将步骤3中离心后的菌在LB固体培养基上观察复筛得到菌落的颜色、形状、光泽、透明程度等形态上的特点；利用电镜观察微生物的形态；20-25℃培养48-72h后进行16sRNA鉴定，如SEQIDNO.1所示，GenBanK号为MK050005，确定菌株属于为柠檬酸杆菌(Citrobactersp.)。3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述的富集培养基配方为：酵母提取物0.5-1％，蛋白胨1-3％，氯化钠1-2％。4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述的固体筛选培养基配方为：葡萄糖4.5-6％，蛋白胨0.27-0.45％，KH2PO40.02-0.04％...

【专利技术属性】
技术研发人员：张庆芳，胡善松，迟乃玉，刘春莹，李美玉，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21