聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种聚乳酸‑羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料及应用，本发明专利技术的聚乳酸‑羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料是以聚乳酸和CaCO3分散于二氯甲烷中，得到第一溶液，采用微流控技术，将第一溶液滴入聚乙烯醇水溶液中，通过控制聚乳酸浓度、聚乳酸的滴速、聚乙烯醇水溶液浓度以及搅拌速度，得到均一的聚乳酸‑CaCO3微球。将微球浸入K2HPO4溶液中，与微球表面的CaCO3在恒温水浴下反应，用去离子水和无水乙醇清洗后，真空干燥，获得表面包被羟基磷灰石纳米结构的聚乳酸复合微球。该微球结构稳定、尺寸均一、直径为50‑400μm。将人脂肪间充质干细胞接种在该微球上，可以促进干细胞的增殖，并维持干细胞的干性。

Polylactic acid-hydroxyapatite microspheres with micron, nano and multistage structure and their application

The invention discloses a polylactic acid hydroxyapatite micro-nano multi-level structure composite microsphere material and its application. The polylactic acid hydroxyapatite micro-nano multi-level structure composite microsphere material of the invention disperses polylactic acid and CaCO3 in dichloromethane to obtain the first solution, drips the first solution into polyvinyl alcohol aqueous solution by microfluidic technology, and controls the polyemulsion by controlling the polylactic acid hydroxyapatite micro-nano multi-level structure composite microsphere material. Homogeneous polylactic acid CaCO3 microspheres were obtained by acid concentration, dropping rate of polylactic acid, concentration of polyvinyl alcohol aqueous solution and stirring rate. The microspheres were immersed in K2HPO4 solution and reacted with CaCO3 on the surface of the microspheres in constant temperature water bath. After cleaning with deionized water and absolute ethanol, the microspheres were vacuum dried to obtain polylactic acid composite microspheres coated with hydroxyapatite nanostructures. The microspheres are stable in structure, uniform in size and 50 400 um in diameter. Inoculation of human adipose-derived mesenchymal stem cells onto the microspheres can promote the proliferation of stem cells and maintain the stem cell viability.

【技术实现步骤摘要】
聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料及应用
本专利技术涉及生物医学工程
，具体涉及一种聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料及其在维持干细胞干性中的应用。
技术介绍
干细胞治疗技术在基因治疗、自身免疫性疾病、脑部和神经系统疾病治疗、心血管疾病治疗中显示出巨大的临床应用前景。其中，自体成体干细胞移植的优势尤为突出。成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，产生各种特异的细胞类型。与胚胎干细胞相比，成体干细胞具有诸多的优势，例如：(1)由于每个个体的主要组织相容性复合体(MHC)不同，同种异体胚胎干细胞及其分化组织细胞用于临床会引起免疫排斥，因而限制了其临床应用；而成体干细胞可从患者自身获得，而不存在组织相容性的问题，治疗时可避免长期使用免疫抑制剂对患者的伤害。(2)虽然胚胎干细胞能分化成各种细胞类型，但这种分化是“非定位性”的，目前尚不能控制胚胎干细胞在特定的部位分化成相应的细胞，当前的做法容易导致畸胎瘤；而成体干细胞在应用时不存在上述问题。然而成体干细胞在机体中数量有限，需要体外扩增以满足临床需求。传统的平皿培养存在接触抑制现象，细胞增殖率低，且极易分化或老化，严重影响了干细胞的数量和质量。因此，开发一种新型的维持成体干细胞干性的培养方法迫在眉睫。微球是指由天然或合成的高分子材料(如明胶、壳聚糖、聚乳酸等)制成，粒径在1-1000微米之间。微球的制备方法主要有乳化/溶剂挥发法、喷雾干燥法、超临界二氧化碳法以及微流控法等。制备方法的不同导致制备得到的微球的形貌、结构、性能等都存在差异。目前微球主要用于药物缓释、细胞支架和细胞注射等领域，还未有利用微球促进成体干细胞增殖、并维持成体干细胞干性的报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料。本专利技术的聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料具有良好的细胞相容性，能够促进成体干细胞增殖，细胞存活率在98％以上，且能维持成体干细胞的干性，采用本专利技术的聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料扩增后的成体干细胞具有良好的分化潜能，可以分化为成骨、脂肪以及软骨细胞。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料的制备方法，包括以下步骤：(1)将聚乳酸和碳酸钙溶解于二氯甲烷中，制得第一溶液；(2)采用微流控技术将第一溶液滴入聚乙烯醇水溶液中，在搅拌条件下获得包含碳酸钙的聚乳酸微球；(3)将包含碳酸钙的聚乳酸微球浸入K2HPO4溶液中，于20-30℃恒温水浴下反应3-7天，收获微球，洗涤，干燥，即制备得到聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料。步骤(1)中，所述第一溶液中，聚乳酸的重量百分含量为1-10％，聚乳酸的分子量为5万-50万，碳酸钙的重量百分含量为1-10％。步骤(2)中，所述采用微流控技术将第一溶液滴入聚乙烯醇水溶液中，具体为：微通道的孔径为40-400μm，滴入速度为0.01mL/min-3mL/min。步骤(2)中，所述聚乙烯醇水溶液的浓度为1mg/mL-10mg/mL。步骤(2)中，搅拌的速度为100rpm-1000rpm。步骤(3)中，所述K2HPO4溶液的浓度为0.01mol/L-0.25mol/L，pH值为6.8-7.2。本专利技术的第二方面，提供上述方法制备的聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料。所述聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料的直径为50-400μm。本专利技术的第三方面，提供上述聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料在如下1)-3)至少一项中的应用：1)促进成体干细胞增殖、并维持成体干细胞干性；2)成体干细胞的体外扩增；3)制备促进成体干细胞增殖、并维持成体干细胞干性的培养体系。本专利技术的第四方面，提供一种能够促进成体干细胞增殖、并维持成体干细胞干性的培养体系，所述培养体系以上述的聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料为有效成分。本专利技术的第五方面，提供一种体外扩增成体干细胞的方法，包括以下步骤：将成体干细胞接种至上述培养体系中，进行扩增培养。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术的聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料，其制备条件温和，无需高温、高压反应条件，制备的复合微球材料粒径均一、形态可控。(2)本专利技术的聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料具有良好的细胞相容性，能够促进成体干细胞增殖，细胞存活率在98％以上，且能维持成体干细胞的干性，采用本专利技术的聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料扩增后的成体干细胞具有良好的分化潜能，可以分化为成骨、脂肪以及软骨细胞。附图说明：图1：本专利技术的聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料的制备流程图。图2：本专利技术的聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米复合微球的结构示意图。图3：CCK8染色显示生长在聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料上的脂肪间充质干细胞的增殖情况；其中，正常组为生长在培养皿中的细胞；材料组1-3分别为生长在实施例1-3获得的聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球的细胞。图4：在不同材料上培养脂肪间充质干细胞7天后的AM-PI染色；其中，正常组为生长在培养皿中的细胞；材料组为生长在实施例3获得的聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球的细胞。绿色为钙黄素染色，红色为PI染色。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
技术介绍
部分介绍的，现有的成体干细胞体外扩增方法，其细胞繁殖率低，且在增殖培养的过程中极易分化或老化，严重影响成体干细胞的数量和质量。基于此，本专利技术的目的是提供一种新型的能够促进成体干细胞增殖、且能维持干细胞干性的培养方法。传统的微球一般是用于药物缓释、细胞支架和细胞注射等领域，特别是作为药物的载体，目前还未有关于微球在干细胞增殖和干细胞干性维持中的报道。而本专利技术首次提出可以利用特定形貌和结构组成的聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料来促进成体干细胞的增殖，并维持干细胞的干性。在本专利技术的一种实施方案中，给出了聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料的制备方法(如图1所示)，包括以下步骤：以聚乳酸微球为基础单位，在其表面合成羟基磷灰石纳米结构；具体为：将聚乳酸和CaCO3溶解于二氯甲烷中，采用微流控技术，将溶液滴入聚乙烯醇水溶液中，在搅拌条件获得包含CaCO3的聚乳酸微球，将微球浸入K2HPO4溶液中，于20-30℃恒温水浴下反应3-7天，用去离子水清洗三次，再用无水乙醇清洗后，真空干燥，获得表面包被羟基磷灰石纳米结构的聚乳酸微球(如图2所示)。羟基磷灰石因具有良好的生物相容性目前被广泛用作组织工程，特别是骨科相关研究。羟基磷灰石的获取方法主要有水热法、化学沉积法、溶胶-凝胶法等，其中，水热法需要高温高压条件；溶胶-凝胶法需要碱性条件且要高温处理；这些方法均不适合用于在聚乳酸凝胶上生长羟基磷灰石。为实现在聚乳酸微球表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚乳酸‑羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将聚乳酸和碳酸钙溶解于二氯甲烷中，制得第一溶液；(2)采用微流控技术将第一溶液滴入聚乙烯醇水溶液中，在搅拌条件下获得包含碳酸钙的聚乳酸微球；(3)将包含碳酸钙的聚乳酸微球浸入K2HPO4溶液中，于20‑30℃恒温水浴下反应3‑7天，收获微球，洗涤，干燥，即制备得到聚乳酸‑羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料。

【技术特征摘要】
1.一种聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将聚乳酸和碳酸钙溶解于二氯甲烷中，制得第一溶液；(2)采用微流控技术将第一溶液滴入聚乙烯醇水溶液中，在搅拌条件下获得包含碳酸钙的聚乳酸微球；(3)将包含碳酸钙的聚乳酸微球浸入K2HPO4溶液中，于20-30℃恒温水浴下反应3-7天，收获微球，洗涤，干燥，即制备得到聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一溶液中，聚乳酸的重量百分含量为1-10％，聚乳酸的分子量为5万-50万，碳酸钙的重量百分含量为1-10％。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述采用微流控技术将第一溶液滴入聚乙烯醇水溶液中，具体为：微通道的孔径为400-800μm，滴入速度为0.01mL/min-3mL/min。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述聚乙烯醇水溶液的浓度为1mg/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙春辉，任娜，刘宏，甘宜梧，张瑞彤，刘佳丽，梁娜，刘振，谢清华，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37