IGFBP3在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途制造技术

本发明专利技术涉及IGF BP3在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途。本发明专利技术发现了IGF BP3蛋白的含量变化对肝癌的状态具有明显的相关性，通过提供能够准确检测IGF BP3蛋白含量的试剂盒，辅助诊断肝癌的存在、分期和转移。

Application of IGFBP3 in the preparation of reagent kit for quantitative detection of hepatocellular carcinoma markers

【技术实现步骤摘要】
IGFBP3在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途
本专利技术属于肿瘤的诊断领域，涉及IGFBP3在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途。
技术介绍
人们谈癌色变。21世纪以来，恶性肿瘤对人类健康的威胁已日趋严重。其致死率仅次于心脑血管疾病，位居第三。肿瘤患者死亡率高的主要原因是不能早期诊断，早期诊断与早期治疗是防治肿瘤与降低死亡率的最有效方法。随着肿瘤细胞的发生，肿瘤患者体内某些蛋白质会发生变化，或产生新的与肿瘤关联的异常蛋白。这些能反应肿瘤存在的化学类物质人们总称为肿瘤标志物。肿瘤标志物是肿瘤细胞在癌变过程中由于基因的表达水平的变化而生成或减少的抗原和其他生物活性物质，有的不存在于正常成人组织而仅见于肿瘤组织，有的在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量。也就是说，肿瘤标志物的存在或量变可以提示肿瘤的性质，所以肿瘤标志物的检测对肿瘤的临床治疗具有巨大的参考意义，可以应用于肿瘤的早期诊断、分期监测肿瘤进程和实时评价药物的治疗效果(ASCO，1996)。为了满足肿瘤的临床诊断和治疗的需求，对肿瘤标志物的研究及对应检测方式的开发发亟待加速。目前，用于临床诊断的肿瘤标志物包括癌胚抗原、酶、激素、糖蛋白、癌基因和细胞表面肿瘤抗原等6大类。美国FDA批准了以下血清肿瘤标志物用于肿瘤的辅助诊断：甲胎蛋白(AFP)，癌胚抗原(CEA)，癌抗原CA125，癌抗原CA19-9，癌抗原CA153，前列腺特异性抗原(fPSA,tPSA)，甲状腺球蛋白(Thyroglobulin)，β人绒毛膜促性腺激素(HCGb)，和人附睾分泌蛋白4(HE4)。另外其他常用于临床诊断的肿瘤标志物还包括神经原特异性烯醇化酶(NSE)，降钙素(PCT)，铁结合蛋白(Ferritin)，β2－微球蛋白(beta2-Microglobin)，胃蛋白酶原(Pepsinogen1,2)，和催乳素(Prolactin)等。这些肿瘤标志物大多缺乏灵敏度和特异性，制约了其在肿瘤诊断中的广泛应用。对于肝癌，甲胎蛋白和超声波检查是普遍采用的诊断高危病人的方式，并且确实显著提高了肝癌病人的生存率，但灵敏度比较低；肿瘤抗原CA-125有更高的灵敏度，但却缺乏特异性。同样地，用于乳腺癌检测的血液肿瘤标志物CA15-3因灵敏度低在早期诊断中几乎没用。因此，肿瘤的早期诊断、以及良性和恶性肿瘤的区分仍然是一个临床难题，需要新的技术和方法来发现新的肿瘤标志物和提高肿瘤标志物检测的灵敏度和可信度。胰岛素生长因子结合蛋白(IGFBP)是可通过胰岛素样生长因子依赖和非依赖途径调节细胞增殖和凋亡的蛋白家族，近年被认为与部分肿瘤的发生，发展和化疗耐药相关，特别是体内含量较多的IGFBP2、IGFBP3、IGFBP5。人体内血循环中大部分的IGF是与IGFBP相结合的，人体中有6种不同性质的IGFBP(IGFBP-1～IGFBP-6)，其中IGFBP-3与生长激素关系密切，是诊断生长激素缺乏症有价值的指标。IGFBP3与IGF1结合，可阻断IGF1信号通过IGF1受体向核内转导，从而降低IGF1的促肿瘤细胞增殖效应，间接抑制肿瘤生长。然而，为了将IGFBP3应用于肿瘤的诊断与监测，国外在售的IGFBP3重组蛋白价格昂贵，不利于进一步生产开发。而国内生产商研发的IGFBP3重组蛋白溶解性低，不利于试剂盒的制备。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种IGFBP3在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途，以解决上述技术问题中的至少一个。根据本专利技术的一个方面，提供一种IGFBP在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途。优选地，IGFBP3为包含SEQIDNO：2的多肽片段或SEQIDNO：2中一个或两个脯氨酸突变为极性氨基酸的多肽片段。优选地，IGFBP3为包含SEQIDNO：3的多肽片段。根据本专利技术的另一个方面，提供一种用于定量检测肝癌标志物的试剂盒，包括：反向蛋白芯片，用于包被来自待测样品的破碎的微量组织或细胞；检测抗体，其为生物素化抗IGFBP3的单克隆抗体或者基因工程抗体；IGFBP3标准品，其为包含SEQIDNO:2的多肽片段或SEQIDNO:2中的一个或两个脯氨酸突变为极性氨基酸的多肽片段。优选地，IGFBP3标准品肽为包含SEQIDNO：3的多肽片段。优选地，多肽片段的纯度大于95％。优选地，检测抗体为生物素化抗IGFBP3的单克隆抗体，浓度为0.1mg/L。优选地，检测抗体为基因工程抗体scFv、Fab、Fab′和/或F(ab′)2。优选地，标准品包被在采用聚苯乙烯制作的酶标板上。优选地，待测样品取自人类血液。本专利技术通过系统的筛选得出能够可靠地反映肝癌状态的标志物，基于IGFBP3蛋白在肝癌样品中的平均表达水平远远高于健康样品及其与肿瘤的恶性程度的相关性，以IGFBP3蛋白作为检测目标，据此对肝癌进行的预测、诊断、分期、监测等均能达到较高的灵敏度、特异度和精确度。本专利技术对IGFBP3进行氨基酸序列编辑，采用由此得到的重组蛋白作为检测IGFBP3蛋白的标准品，使标准品具有良好的稳定性、亲合力和溶解性，更加容易包被在酶标板上，其与特异性抗体的结合能力更强。使用本专利技术提供的标准品校准测定样品中的IGFBP3蛋白的浓度标准曲线，能够准确地实现IGFBP3蛋白的定量检测。附图说明图1为实施例1中肝癌标志物的筛选流程图；图2为实施例1中训练组的17种因子的ROC曲线图；图3为实施例1中17种因子的交叉验证示意图；图4为实施例1中训练组的6种因子的ROC曲线图；图5为实施例1中6种因子的交叉验证示意图；图6为实施例2中反向蛋白芯片分别检测β2-微球蛋白、IGFBP3蛋白、GP73蛋白、GDF15蛋白、OPN蛋白和AFP蛋白的点样分布及点样结果示意图；图7为实施例2的肝癌样品和健康样品中的IGFBP3蛋白含量对比图；图8为不同IGFBP3标准品检测样本中的IGFBP3的效果图。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。IGFBP3蛋白的表达水平可以通过直接或间接的手段反映，如化学发光法、时间分辨免疫法和免疫印迹法等，实施例1～4将以抗原抗体反应为原理，通过ELISA法和吸光度测试配合测定IGFBP3蛋白的浓度。实施例1肝癌标志物的筛选本实施例的实验志愿者包括癌症患者、其他癌症患者和健康人群，肝癌标志物的筛选流程参照图1所示。基于ELISA法，使来自实验志愿者提供的血清样品充分接触包被有针对274个血清标记物的抗体的抗体芯片，对抗体芯片测试结果进行人工神经网络分析。设置78个肝癌样本、40个其它癌症样本以及80个健康样本，对抗体芯片提供的数据进行归一化处理。采用相关标准品得出目标因子的标准品曲线，根据标准品曲线测定蛋白浓度。由此发现，有21种因子在肝癌样本中的含量明显有别于在其他癌症样本和健康样本中的含量。根据P值<0.01的要求，从中选择符合该要求的17种因子进行统计建模。这17个因子是AFP,GDF15,CEACAM1,MMP9,GP73,B2M,IGFBP3,ACRP30,Ferritin,Axl,LYVE-1,Fas,本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种IGFBP3在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途。

【技术特征摘要】
1.一种IGFBP3在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述IGFBP3为包含SEQIDNO：2的多肽片段或SEQIDNO：2中一个或两个脯氨酸突变为极性氨基酸的多肽片段。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于：所述IGFBP3为包含SEQIDNO：3的多肽片段。4.一种用于定量检测肝癌标志物的试剂盒，其特征在于，包括：反向蛋白芯片，用于包被来自待测样品的破碎的微量组织或细胞；检测抗体，其为生物素化抗IGFBP3的单克隆抗体或者基因工程抗体；IGFBP3标准品，其为包含SEQIDNO:2的多肽片段或SEQIDNO:2中的一个或两个脯氨酸突变为极性氨基酸的多肽片段。5.如权利要求4所述用于定量检测肝...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄若磐，匡治州，黄伟，毛应清，
申请(专利权)人：广州瑞博奥生物科技有限公司，广州瀚普创展医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44