本发明专利技术公开了一种生物活性多肽及其在制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。所述生物活性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为AGI‑1。AGI‑1由十个氨基酸残基组成，其中含有两个半胱氨酸，形成一对分子内二硫键，经过MALDI‑TOF质谱检测其分子量为1102.3 Da。多肽AGI‑1的纯化冻干粉的理化性状为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明。AGI‑1可以抑制α‑葡萄糖苷酶活性，其IC50值为1.54 mM。
A Bioactive Polypeptide and Its Application in the Preparation of a-Glucosidase Inhibitor
The invention discloses a bioactive polypeptide and its application in the preparation of a glucosidase inhibitor. The amino acid sequence of the bioactive polypeptide is named AGI_1 as shown in SEQ ID NO.1. AGI 1 is composed of ten amino acid residues, which contain two cysteines, forming a pair of intramolecular disulfide bonds. Its molecular weight is 1102.3 Da by MALDI TOF mass spectrometry. The physical and chemical properties of the purified freeze-dried powder of polypeptide AGI 1 are white or quasi-white loose body, odorless, easily soluble in water and nearly colorless and transparent in aqueous solution. AGI 1 could inhibit the activity of alpha-glucosidase, and its IC50 value was 1.54 mM.
【技术实现步骤摘要】
一种生物活性多肽及其在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种生物活性多肽及其在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
技术介绍
糖尿病是一种由高血糖和长期高血糖而引发的一类代谢类疾病。糖尿病可以使得患者的心脏、肝脏、肾脏和神经等器官组织造成损伤，还可能造成机体内分泌紊乱。目前，世界有超过3亿人患有糖尿病，而这一数字有望在2030年增加到5亿以上。而中国则有大约1.14亿人口患有糖尿病，中国已经成为了世界上最大的糖尿病国家。α-葡萄糖苷酶是一种存在于小肠刷状缘的水解酶，其可以从淀粉的非还原末端水解α-1,4-糖苷键产生葡萄糖，也可以缓慢水解α-1,6-糖苷键产生葡萄糖。通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以降低饮食过程中碳水化合物水解的速度，从而可以降低体内的血糖水平。目前已经有一些小分子α-葡萄糖苷酶抑制剂（例如阿卡波糖和米格列醇等）用于治疗II型糖尿病。研究表明尽管阿卡波糖和米格列醇等可以用于预防葡萄糖耐量异常发展为II型糖尿病，但是其也会产生一定的副作用，例如会造成患者体内代谢紊乱等。随着生物技术与多肽合成技术的日臻成熟，越来越多的多肽药物被开发并应用于临床。由于靶点特异性好、体内易于降解等优点，多肽药物目前已广泛应用于肿瘤、肝炎、糖尿病、艾滋病等疾病的预防、诊断和治疗，具有广阔的开发前景。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种生物活性多肽及其在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。为了达到上述目的，本专利技术通过酵母双杂交的手段获取可以与人肠α-葡萄糖苷酶中的葡萄糖淀粉酶结构域相互作用的一条随机多肽，其序列如SEQIDNO.1所示：NH2-Thr-His-Cys-Asn-Lys-Ser-Cys-Thr-Pro-Asn-OH（NH2-THCNKSCYPN-OH）（SEQIDNO.1）。该多肽命名为AGI-1，其含有10个氨基酸残基，经MALDI-TOF质谱鉴定其分子量为1102.3Da。该多肽编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：5’-ACTCATTGTAATAAGTCTTGTACTCCGAAT-3’（SEQIDNO.2）。多肽AGI-1冻干后的纯品为白色疏松体，无气味，极易溶解于水。该多肽能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其IC50值为1.54mM。附图说明图1为AGI-1的RP-HPLC分离纯化图谱，其中箭头表示目的峰；图2为AGI-1的MALDI-TOF质谱鉴定图谱，其中箭头表示目的峰；图3为AGI-1对α-葡萄糖苷酶抑制活性浓度-抑制率曲线。具体实施方式本专利技术中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规操作技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本专利技术申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。实施例1酵母双杂交的手段获取阳性克隆，并自激活验证采用Clontech公司的MATCHMAKERGALTwo-HybridSystem3系统进行酵母双杂交实验。具体步骤是：1）将含有人肠α-葡萄糖苷酶中的葡萄糖淀粉酶结构域诱饵质粒（BD）转入酵母菌株AH109，并将其采用PEG/LiAc的方法制备成感受态；2）取10μg随机二十肽多肽文库的质粒DNA转入前一步的感受态；3）最后将感受态细胞涂在生长缺陷型培养基上，30℃培养，直至阳性克隆长出；4）将阳性克隆进行小规模扩大培养，提取质粒，回转入AH109，涂在合适的缺陷型培养基上进行重复实验与自激活验证；5）将没有自激活的阳性质粒送去测序公司进行DNA测序。通过以上步骤，我们筛选到1个文库质粒能与BD质粒进行相互作用，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：5’-ACTCATTGTAATAAGTCTTGTACTCCGAAT-3’；其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：NH2-Thr-His-Cys-Asn-Lys-Ser-Cys-Thr-Pro-Asn-OH（NH2-THCNKSCYPN-OH）。实施例2化学多肽合成候选多肽序列采用Fmoc保护策略在CEMLiberty微波辅助全自动多肽合成仪上合成多肽，微波功率为35W，最高反应温度为75℃。使用RinkAmideNovaPEG树脂，以20%哌啶/DMF溶液作为脱保护剂，肽键形成采用HBTU偶联，反应物按树脂载量4倍摩尔数投料。多肽链构建完成后，得到2g肽树脂。将肽树脂进行裂解，减压除去TFA，沉淀出粗肽。然后将粗肽通过RP-HPLC进行纯化（图1为RP-HPLC纯化图谱，乙腈浓度从5%-30%进行洗脱），MALDI-TOF-MS分析目标产物（见图2），冷冻干燥等步骤，最终得到高纯度的多肽冻干粉。实施例3体外酶活实验检测多肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性在96孔酶标板孔中依次加入112μL0.1mol/LPBS（pH＝6.8）、20μL0.2U/mLα-葡萄糖苷酶以及8μL多肽溶液(用PBS配制不同浓度的多肽溶液)，混匀后于37℃恒温反应15min后加入20μL2.5mmol/L4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），混匀后于37℃恒温反应15min后加入80μL0.2mol/L的Na2CO3溶液终止反应，通过酶标仪检测其在405nm波长下的吸光度值，重复实验3次，取平均值。酶活性抑制率的公式：I％＝[1－(A1－A2)/(A3－A4)]×100%；式中：A1为样液组的吸光度值，A2为以PBS代替酶溶液测得的样液组背景吸光度值，A3为以PBS溶液代替样液测得的空白对照组吸光度值，A4为以PBS溶液代替样液与以PBS溶液代替酶溶液测得的空白对照组背景吸光度值。经检测，多肽对α-葡萄糖苷酶具有抑制活性，其IC50值为1.54mM（见图3）。SEQUENCELISTING<110>中南大学湘雅医院<120>一种生物活性多肽及其在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>10<212>PRT<213>人工合成<400>1ThrHisCysAsnLysSerCysTyrProAsn1510<210>2<211>30<212>DNA<213>人工合成<400>2actcattgtaataagtcttgtactccgaat30本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生物活性多肽，其特征在于，所述生物活性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
【技术特征摘要】
1.一种生物活性多肽，其特征在于，所述生物活性多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的生物活性多肽，其特征在于，所述生物活性多肽的IC50值为1.54mM，分子量为110...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋延民，龙莉莉，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：湖南,43
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