α-葡聚糖制造技术

本发明专利技术涉及多糖和低聚糖以及其膳食效果的领域。具体地讲，本发明专利技术涉及一种制备包含(α1→3)连接的D‑葡萄糖单元的α‑葡聚糖的方法。本发明专利技术还提供一种包含交替的(α1→4)和(α1→3)糖苷键并且具有(α1→3，4)支化点的支化α‑葡聚糖、一种食物组合物、以及α‑葡聚糖转移酶用于减少含淀粉的食物材料的可消化性碳水化合物的用途。本发明专利技术的另外方面为细菌、酶和表达载体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】α-葡聚糖
本专利技术涉及多糖和低聚糖及其膳食效果的领域。具体地讲，本专利技术涉及一种制备包含(α1→3)连接的D-葡萄糖单元的α-葡聚糖的方法。本专利技术还提供一种包含交替的(α1→4)和(α1→3)糖苷键并且具有(α1→3，4)支化点的支化α-葡聚糖、一种食物组合物、以及α-葡聚糖转移酶用于减少含淀粉的食物材料的可消化性碳水化合物的用途。本专利技术的另外方面为细菌、酶和表达载体。
技术介绍
肥胖症和超重的患病率在全球迅速增加。开发具有高饱腹感和低能量密度的食物可有助于防止体重增加并促进体重减轻。与含糖食物和饮料相比，食用含非消化性碳水化合物来代替糖的食物和饮料引起餐后血糖升高较少。人类饮食中最常见的碳水化合物是淀粉。这种多糖由大多数绿色植物作为能量存储而产生。在诸如马铃薯、小麦、玉米、稻米和木薯之类的主食中含有大量淀粉。已经提出各种方法来将淀粉和麦芽低聚糖化学改性成非消化性碳水化合物。EP2427565描述了罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)121GTFB的葡聚糖转移酶将淀粉转化为含相对较长异麦芽低聚糖单元的线性葡萄低聚糖的用途。此类材料部分地耐受消化，因此在食用时产生较少葡萄糖产物，从而有助于预防肥胖和Ⅱ型糖尿病。直链淀粉是具有唯一(α1→4)键和高消化率的α-葡聚糖。引入(α1→3)连接的D-葡萄糖单元降低了消化率。来自石蕊属的地衣产生在线性结构中具有交替的(α1→3)和(α1→4)键的α-葡聚糖[Woranovicz-Barreiraetal.，Phytochemistry，52，1069-1074(1999)(Woranovicz-Barreira等人，《植物化学》，第52期，第1069-1074页，1999年)]，但这些α-葡聚糖是水不溶性的，限制了它们的膳食应用。希望提供另外的方式来酶促改性淀粉、淀粉衍生物和麦芽低聚糖，以改变其功能特性并增强其营养价值。所获得的材料应将低消化率和良好溶解性理想地结合在一起。具体地讲，有利的是提供适用于食物制造并且表现出良好的酶活性和热稳定性的酶来执行此类改性。不能将本说明书中对现有技术文献中的任何参考视为承认此类现有技术为众所周知的技术或构成本领域普遍常识的一部分。如本说明书中所用，词语“包括”、“包含”和类似词语不应理解为具有排他性或穷举性的含义。换句话讲，这些词语旨在意指“包括但不限于”。
技术实现思路
本专利技术的目的是改良现有技术，并且提供用于将淀粉和其它多糖或低聚糖酶促改性成具有降低的消化率的物质的改良解决方案，或者至少提供有用的替代方案。本专利技术的目的可通过独立权利要求的主题实现。从属权利要求进一步拓展本专利技术的构想。因此，在第一方面，本专利技术提供一种制备包含(α1→3)连接的D-葡萄糖单元的α-葡聚糖的方法，该方法包括使在其非还原端包含至少两个(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的多糖或低聚糖底物与能够裂解(α1→4)糖苷键并引入新(α1→3)糖苷键的α-葡聚糖转移酶接触，以形成具有与(α1→3)糖苷键交替的(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的线性部分的葡萄糖聚合物，而不形成连续的(α1→3)糖苷键；其中所述α-葡聚糖转移酶选自GTFB、GTFC和GTFD类型的酶或其具有指定酶活性的功能性同源物。在第二方面，本专利技术涉及一种包含与(α1→3)糖苷键交替的(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的线性部分并且具有(α1→3，4)支化点的α-葡聚糖，其中α-葡聚糖具有至少3％的支化比，包含小于1重量％的连续(α1→3)键，并且具有5×102Da至1×107Da的平均分子量。本专利技术第三方面涉及一种包含α-葡聚糖的食物组合物，其中该α-葡聚糖包含与(α1→3)糖苷键交替的(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的线性部分并且具有(α1→3，4)支化点，其中α-葡聚糖具有至少3％的支化比，包含小于1重量％的连续(α1→3)键，并且具有5×102Da和1×107Da的平均分子量。本专利技术的另一方面是包含与SEQIDNO：1具有至少80％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖转移酶用于减少含淀粉的食物材料的可消化性碳水化合物的用途。本专利技术的另一方面是细菌菌株发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)CNCMI-5068(NCC2970)。乳酸菌具有多种葡聚糖蔗糖酶(GS)，这些酶属于配醣水解酶家族70(GH70)，通过形成(α1→2)-、(α1→3)-、(α1→4)-和/或(α1→6)-糖苷键将蔗糖转化成α-葡聚糖多糖。近年来，已经确定了3个新的GH70酶亚族，其对于蔗糖为非活性的，但使用麦芽糖糊精/淀粉作为底物(例如罗伊氏乳杆菌121的GTFB，在EP2248907中有述)。与通过GS发现的宽泛键特异性相比，所有表征的利用GH70酶的非蔗糖排他地显示出4，6-α-葡聚糖转移酶活性(4，6-α-GTase)。它们裂解(α1→4)-键并合成新的(α1→6)-键，产生具有交替的α(1→4)/(1→6)键的线性(α1→6)α-葡聚糖链或支链聚合物。本专利技术人在发酵乳杆菌NCC2970的基因组中鉴定出针对推定的GTFB样GH70家族酶(1593个氨基酸，180kDa)的单个基因编码。该蛋白质与罗伊氏乳杆菌121GTFB4，6-α-GTase具有77％的序列同一性，但在GS中形成底物结合残基的一些残基中显示出独特的变异。该发酵乳杆菌GTFB酶的生物化学表征，包括其得自直链淀粉的产物的详细结构分析，显示它作为4，3-α-葡聚糖转移酶(4，3-α-GTase)起作用，裂解(α1→4)-键并在线性或支链取向上形成新的(α1→3)-键。该酶无法合成连续的(α1→3)-键，并且其活性导致形成具有交替的α(1→3)/(1→4)-键并且具有(1→3，4)支化点的新型α-葡聚糖。在GH70家族和GH-H部族中发现这种新的反应特异性扩展了可合成的α-葡聚糖的范围，并且能够鉴定控制GTFB样GH70亚族酶的活性位点内的键特异性的关键位置。由发酵乳杆菌GTFB酶形成的α-葡聚糖的1D1HNMR分析显示存在(α1→4)和(α1→3)键。α-葡聚糖的甲基化分析显示存在末端、3-取代、4-取代和3，4-二取代的吡喃葡萄糖残基。3-取代和3，4-二取代的吡喃葡萄糖残基的存在意味着GTFB酶在线性和支链取向上形成(α1→3)键。仅检测到痕量(小于1％)的(α1→6)键。根据2DNMR光谱和Smith降解分析，未观察到两个连续(α1→3)-连接的吡喃葡萄糖残基的证据。因此，通过甲基化分析检测到的所有3-取代的吡喃葡萄糖残基必须是(α1→4)连接的，在结构中形成(α1→3)支化点，或者是与单个(α1→3)键交替的(α1→4)键的线性部分的一部分。附图说明图1示出一个系统发育树，其构建依据为CAZy数据库(http：//www.CAZy.org)中注释的一些特征性GH70蛋白质和使用发酵乳杆菌GH70NCC2970蛋白质作为查询序列(以粗体显示)通过BLAST搜索鉴定的(推定)GH70GTFB样蛋白质的完整氨基酸序列比对。使用基于JTT矩阵模型的最大似然法推断出进化历史。条形表示每个位置0.2个取代的遗传距离(20％氨基酸序列差异)。与主节点相邻的步长值表示基于1000个重复的概率。蛋白质序列通过其Genbank本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.制备包含(α1→3)连接的D‑葡萄糖单元的α‑葡聚糖的方法，所述方法包括使在其非还原端包含至少两个(α1→4)连接的D‑葡萄糖单元的多糖或低聚糖底物与能够裂解(α1→4)糖苷键并建立新(α1→3)糖苷键的α‑葡聚糖转移酶接触，以形成具有与(α1→3)糖苷键交替的(α1→4)连接的D‑葡萄糖单元的线性部分的葡萄糖聚合物，而不形成连续的(α1→3)糖苷键；其中所述α‑葡聚糖转移酶选自GTFB、GTFC和GTFD类型的酶或其具有指定酶活性的功能性同源物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.02 EP 16172606.21.制备包含(α1→3)连接的D-葡萄糖单元的α-葡聚糖的方法，所述方法包括使在其非还原端包含至少两个(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的多糖或低聚糖底物与能够裂解(α1→4)糖苷键并建立新(α1→3)糖苷键的α-葡聚糖转移酶接触，以形成具有与(α1→3)糖苷键交替的(α1→4)连接的D-葡萄糖单元的线性部分的葡萄糖聚合物，而不形成连续的(α1→3)糖苷键；其中所述α-葡聚糖转移酶选自GTFB、GTFC和GTFD类型的酶或其具有指定酶活性的功能性同源物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述α-葡聚糖转移酶包含与SEQIDNO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述α-葡聚糖转移酶为发酵乳杆菌GTFB酶。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述底物具有至少五的聚合度。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述底物选自淀粉、淀粉衍生物、麦芽低聚糖、葡萄糖低聚糖、直链淀粉、支链淀粉、麦芽糖糊精、(α1→4)葡聚糖以...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·戴克修森，J·冈戈提穆纳卡斯，S·S·范莱文，C·瓦菲亚迪，S·杜布克斯，
申请(专利权)人：雀巢产品技术援助有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH