一种光控示踪剂在探测蛋白质的寡聚状态中的应用制造技术

本发明专利技术属于蛋白质结构检测技术领域，具体涉及一种光控示踪剂在探测蛋白质的寡聚状态中的应用。本发明专利技术单体荧光蛋白标记的SxIP模体可以广泛用于探测细胞中蛋白质的寡聚状态，可以准确反映胞内蛋白的真实状态。

Application of a Phototracer in Detecting Oligomeric State of Protein

The invention belongs to the technical field of protein structure detection, in particular to the application of a light-controlled tracer in detecting oligomeric state of protein. The SxIP motif labeled by the monomer fluorescent protein of the invention can be widely used to detect the oligomerization state of proteins in cells, and can accurately reflect the true state of intracellular proteins.

【技术实现步骤摘要】
一种光控示踪剂在探测蛋白质的寡聚状态中的应用
本专利技术属于蛋白质结构检测
，具体涉及一种光控示踪剂在探测蛋白质的寡聚状态中的应用。
技术介绍
微管蛋白(MT)是高度动态的聚合物，在细胞分裂和细胞内运输等生物过程中发挥重要作用。微管蛋白细胞骨架由于蛋白调节子(包括微管相关蛋白(MAPs)和分子马达)的协调作用，以空间和时间受控的方式经历动态变化。值得注意的是，微管加端追踪蛋白(+TIPs)含有高度保守的SxIP模体，其特异性结合末端结合(EB)蛋白，因此可用于追踪微管加端。微管蛋白翻译后修饰(PTM)，例如去酪氨酸，乙酰化，聚谷氨酰化和聚甘氨酸化，使得微管在细胞和生物体内显示出多样化的功能。微管蛋白(MT)和翻译后修饰的失调可能导致基因组不稳定和细胞周期停滞，并常常与人类疾病相关，如癌症，心血管疾病和神经疾病。可视化微管蛋白(MT)的时间和空间分和翻译后修饰的动力学对于理解MT在细胞生长和分化过程中在各种细胞类型中的功能是至关重要的。迄今为止，已经应用了多种技术来鉴定活细胞中蛋白质自缔合的状态，包括福斯特共振能量转移(FRET)技术，双分子荧光互补(BiFC)技术，荧光相关光谱(FCS)技术和荧光波动光谱(FFS)技术。然而，FRET和BiFC更适合区分蛋白质从单体到寡聚体的聚集状态，而不提供关于其寡聚体状态的具体信息。此外，FCS和FFS的应用目前受限于灵敏度低，复杂的仪器和复杂的图像后处理。亟需直接读出的简单方法：可以在实验室中常规使用，同时避免费力的蛋白质表达和纯化程序，以帮助定量表征细胞内的蛋白质。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种光控示踪剂在探测蛋白质的寡聚状态中的应用。本专利技术利用EB1蛋白共有的SxIP模体融合不同聚集状态的蛋白时，其显示的MT标记(MT/cytosol的比例来量化)与其聚集的状态成正比例关系，在活细胞内可以区分鉴别蛋白的单体、二、三和四聚体状态。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术目的之一，提供一种光控示踪剂，所述光控示踪剂包含单体荧光蛋白和SxIP模体。优选的，所述SxIP模体为腺瘤性息肉病菌APC，肌动蛋白DST或基质相互作用分子1的SxIP模体。优选的，所述腺瘤性息肉病菌APC的SxIP模体为APC2786-2824，氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；肌动蛋白DST的SxIP模体为DST5469-5485或DST5474-5485；所述DST5469-5485氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；所述DST5474-5485氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；所述基质相互作用分子1的SxIP模体为STIM1630-685或STIM1630-660；所述STIM1630-685氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，所述STIM1630-660氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。优选的，所述单体荧光蛋白为mCherry、GB1或GFP。本专利技术目的之二，提供所述光控示踪剂的构建方法：包括以下步骤：(1)通过标准PCR扩增SxIP模体；(2)在pmCherry-C1/下游的BspEI和EcoRI/BamHI位置插入所扩增的SxIP模体，得到mCherry(mCh)标记的SxIP模体，即得。本专利技术目的之三，提供所述示踪剂探测蛋白质的低聚状态的方法，包括以下步骤：(1)构建如权利要求1所述的光控示踪剂；(2)将待测蛋白质与光控示踪剂进行融合；(3)通过测定荧光信号比率Fcomet/Fcytosol，代入以下公式：所得n值即为待测蛋白质的低聚状态数目。优选的，步骤(2)具体步骤为：将待测蛋白质插入到光控示踪剂的单体荧光蛋白和SxIP模体之间。本专利技术目的之四，提供所述光控示踪剂在探测蛋白质的低聚状态中的应用。本专利技术目的之五，提供所述光控示踪剂在筛选控制蛋白质二级结构的关键结构子的应用。本专利技术目的之六，提供所述光控示踪剂在检测触发蛋白质单体到寡聚体转变中的应用。本专利技术原理：微管加端末端蛋白(+TIPs)利用SxIP模体通过与中心衔接蛋白(末端结合蛋白1，EB1)直接相互作用追踪延伸微管的末端，末端结合蛋白1(EB1)包含N-末端微管蛋白结合钙调蛋白同源性(CH)结构域，是一个能够招募+TIPs的中心接头和C末端EB同源(EBH)结构域。单独表达时，单体荧光蛋白(mCherry)标记的SxIP模体几乎不能跟踪微管末端。当融合不同聚集状态的蛋白时，由于聚集蛋白触发的SxIP模体寡聚化会增加对微管蛋白加端的亲和力，此时，其显示的对微管的标记(微管荧光强度/胞质中荧光强度的比例来量化)与其聚集的状态成正比例关系，在活细胞内可以区分鉴别蛋白的单体、二、三和四聚体状态。本专利技术原理：微管加端末端蛋白(+TIPs)利用SxIP模体通过与中心衔接蛋白(末端结合蛋白1，EB1)直接相互作用追踪延伸微管的末端，末端结合蛋白1(EB1)包含N-末端微管蛋白结合钙调蛋白同源性(CH)结构域，是一个能够招募+TIPs的中心接头和C末端EB同源(EBH)结构域。单独表达时，单体荧光蛋白(mCherry)标记的SxIP模体几乎不能跟踪微管末端。当融合不同聚集状态的蛋白时，由于聚集蛋白触发的SxIP模体寡聚化会增加对微管蛋白加端的亲和力，此时，其显示的对微管的标记(微管荧光强度/胞质中荧光强度的比例来量化)与其聚集的状态成正比例关系，在活细胞内可以区分鉴别蛋白的单体、二、三和四聚体状态。与现有技术相比，本专利技术具有以下优势：(1)蛋白质的寡聚状态通常在体外用生物化学或生物物理学分析方法进行研究，这涉及繁琐的步骤去纯化靶标，忽略了细胞内环境的复杂性，因而不能准确实时反映细胞内蛋白的寡聚状态。本专利技术单体荧光蛋白标记的SxIP模体可以广泛用于探测细胞中蛋白质的寡聚状态，可以准确反映胞内蛋白的真实状态。(2)荧光能量转移(FRET)检测经常用来测量亚细胞同源寡聚化，但是它往往不能区分二聚体和更高级寡聚体。本专利技术单体荧光蛋白标记的SxIP模体可以区分鉴别蛋白的单体、二、三和四聚体状态，并且定量剖析完整细胞内的蛋白质在其原生环境中的未知结构。附图说明图1源自APC，肌动蛋白(DST或MACF2)和STIM1的EB1结合SxIP模体与光交换部分CRY2-PHR(氨基酸1-498)融合以产生19个OptoTIP变体(V1-V19)。APC，腺瘤性结肠息肉病(APC)；MTBD，微管结合结构域；DST，dystonin；GAS2，生长抑制特异性2；STIM1，基质相互作用分子1；SP，信号肽；EF-SAM，EF-hand和不育的α模体；TM，跨膜结构域；CC1，卷曲螺旋；SOAR或CAD，STIM1Orai激活区或CRAC激活结构域；ID，抑制域；PS，脯氨酸-丝氨酸富集序列；K，多元富含赖氨酸的结构域。图2表达与mCh-SxIP融合的寡聚蛋白的HeLa细胞的共聚焦图像。在顶部显示了指示的蛋白质的三维结构：单体mCherry(mCh)，二聚谷胱甘肽S-转移酶(GST)，三聚耐盐蛋白3(AtHAL3)和四聚体DsRed。图3SxIP作为融合标签来诱导彗星形成并监测蛋白质的寡聚状态(与图4相关)。比例尺，5微米。(a-d)表示与mCh-SxIP-V2融合的蛋白的HeLa细胞的代表性共焦图像(DST5469-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种光控示踪剂，其特征在于，所述光控示踪剂包含单体荧光蛋白和SxIP模体。

【技术特征摘要】
1.一种光控示踪剂，其特征在于，所述光控示踪剂包含单体荧光蛋白和SxIP模体。2.根据权利要求1所述光控示踪剂，其特征在于，所述SxIP模体为腺瘤性息肉病菌APC，肌动蛋白DST或基质相互作用分子1的SxIP模体。3.根据权利要求1所述光控示踪剂，其特征在于，所述腺瘤性息肉病菌APC的SxIP模体为APC2786-2824，氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；肌动蛋白DST的SxIP模体为DST5469-5485或DST5474-5485；所述DST5469-5485氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；所述DST5474-5485氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；所述基质相互作用分子1的SxIP模体为STIM1630-685或STIM1630-660；所述STIM1630-685氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，所述STIM1630-660氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。4.根据权利要求1所述光控示踪剂，其特征在于，所述单体荧光蛋白为mCherry、GB1或GF...

【专利技术属性】
技术研发人员：李敏勇，周育斌，杜吕佩，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37