精子活化剂及其用途制造技术

本发明专利技术的课题在于提供对受精卵移植和生殖医疗的发展有用的技术。本发明专利技术提供精子活化剂以及利用该精子活化剂的人工授精方法，所述精子活化剂以选自来源于脂肪组织的干细胞、来源于牙髓的干细胞、来源于骨髓的干细胞以及来源于脐带血的干细胞中的一种以上的细胞的破碎物为有效成分。

Sperm Activator and Its Application

The subject of the present invention is to provide techniques useful for the development of fertilized egg transplantation and reproductive medicine. The invention provides a sperm activator and an artificial insemination method using the sperm activator. The sperm activator is composed of stem cells from adipose tissue, stem cells from dental pulp, stem cells from bone marrow and more than one kind of broken cells from cord blood.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】精子活化剂及其用途
本专利技术涉及可在畜产领域和医疗(生殖医疗)领域利用的技术。详细而言，本专利技术涉及精子活化剂及其用途。本申请主张基于2016年8月24日提出申请的日本专利申请第2016－164159号的优先权，该专利申请的全部内容通过参照而援引入本申请说明书中。
技术介绍
在畜产中，将以高价销售的黑毛和种肉牛的受精卵移植于荷斯坦种奶牛的子宫，进行由奶牛生产肉牛的受精卵移植。根据该技术，出生后的肉牛的仔牛能够以高价销售，另一方面，分娩后的奶牛开始泌乳(即，能够挤奶)，因此，真是一举两得。在该技术中，首先对肉牛的雌性牛人工授精肉牛的雄性牛的精液，将受精卵从子宫取出。将取出的受精卵移植于奶牛的子宫。需要移植正常的受精卵，但供于人工受精的能够从肉牛采取的正常的受精卵的数量每次采取均大幅不同，也有得不到足够数量的正常受精卵的情况。另一方面，对于荷斯坦种奶牛，随时需要生产后继牛，但在通常的人工授精中雄性和雌性仔牛的比例各以约50％出生。由于能够挤奶的个体局限于雌性牛(换言之，雄性荷斯坦种仔牛没有作为奶牛的价值)，因此，期望出生的荷斯坦种仔牛为雌性。响应该需求，近年来，开发了从精液中仅分选受精时受精卵成为雌性的精子(X精子)的方法(通过流式细胞仪分离受精卵成为雄性的X精子和受精卵成为雌性的Y精子，人工受精用途中仅将X精子进行冷冻保存)，可销售通过该方法得到的冷冻精液(性别分选精液)。但是，由于分选的过程中精子的运动性降低，因此，现状是这样的“性别分选精液”与通常的冷冻精液相比受孕率低。虽然开发了提高性别分选精液的受孕率的方法，但现状是性别分选精液的受孕率仍未达到通常的冷冻精液的受孕率。此外，本申请人在来源于脂肪组织的干细胞(称为Adipose-derivedstemcells：ASC,Adipose-derivedregenerationcells：ADRC,Adipose-derivedmesenchymalstemcells：AT-MSC,AD-MSC等)具有饲养细胞的作用，并且还积极地作用于生殖过程的假说下进行研究，发现在体外(invitro)ASC具有将精子和卵子活化的作用，进行了专利申请(专利文献1、2)。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2015－82987号公报专利文献2：日本特开2016－7161号公报
技术实现思路
在黑毛和种肉牛的受精移植中。期望高效且稳定地采取大量的正常受精卵，但留下许多受精卵的采取数量降低、所采取的数量的变动大等需要解决的问题点。另一方面，荷斯坦种奶牛的性别分选精液出于仅生产雌性仔牛(将来生产牛奶的个体)的目的而制作，并以冷冻精液的形式销售，但如上所述，与通常的冷冻精液相比受孕率低，强烈要求提高受孕率。另外，不限于牛，对于其它家畜的人工授精，也期望头提高精子的运动率、受孕率。例如，由于夏季的室内温度上升，因此，每年夏季均发生所谓被称为夏季不孕症的猪精子的运动率降低，对人工授精用精液的供给带来不稳定性。另一方面，现代社会中因不孕症而烦恼的夫妇多，对其应对法(治疗法)的需求大。不孕症中，主要原因在男性方面发现的疾病称为男性不孕症。作为男性不孕症之一，有因阴嚢静脉回流或瘀滞而睾丸温度上升，精子运动率降低的精索静脉瘤的病态。本专利技术的课题在于应对畜产领域、医疗领域的上述期望，促进受精卵移植或生殖医疗的改进、发展。为了解决上述课题反复进行了研究，结果得到ASC的细胞破碎液(特别是作为过滤器处理后的细胞破碎液的滤液)在体外(invitro)将精子活化，在体内(invivo)促进人工授精后的卵子的受精和早期发育这样的令人吃惊的见解、成果。并非ASC本身而是在细胞破碎液中发现这样的利用价值如果考虑不需要估计使用的时机而开始细胞培养，其制备、处理容易；由于预先准备材料(即ASC)，因此，使用时的制备时间较短即可等实用上的优点，则其意义极大。此外，使用作为活细胞的ASC本身时，细胞的制备需要几日(通常至少3天的培养)，但如果为细胞破碎液，则通过保存预先培养的细胞，也能够将使用时的制备需要的时间缩短为1小时左右，能够在即将使用之前准备。另一方面，在来源于牙髓的干细胞(DPSC)、来源于骨髓的干细胞(BM-MSC)以及来源于脐带血的干细胞(CB-MSC)的破碎液中也发现与ASC的破碎液的效果(即，精子的活化)同样的效果。另外，通过进一步的研究，成功地鉴定了作为细胞破碎液中大量含有的成分的HSP90α，同时确认了HSP90α实际上将精子活化。以下的专利技术主要是基于上述成果和考察而完成的。[1]一种精子活化剂，选自来源于脂肪组织的干细胞、来源于牙髓的干细胞、来源于骨髓的干细胞以及来源于脐带血的干细胞中的一种以上的细胞的破碎物为有效成分。[2]根据[1]所述的精子活化剂，其中，含有以下的(a)～(d)中的任一种，(a)冷冻状态的细胞，(b)将细胞进行破碎处理而得到的破碎液，(c)将(b)的破碎液进行离心处理而得到的上清液，(d)将(b)的破碎液或(c)的上清液进行过滤器处理而得到的滤液。[3]根据[1]或[2]所述的精子活化剂，使用于人工授精。[4]根据[1]～[3]中任一项所述的精子活化剂，其中，通过精子活化剂活化的精子的生物种与所述细胞的生物种相同。[5]根据[1]～[4]中任一项所述的精子活化剂，其中，所述细胞的生物种为非人哺乳动物。[6]根据[5]所述的精子活化剂，其中，所述非人哺乳动物为牛、猪、马、山羊或绵羊。[7]根据[1]～[4]中任一项所述的精子活化剂，其中，所述细胞的生物种为人。[8]一种人工授精用制剂，是将[1]或[2]所述的精子活化剂填充于容器而成的。[9]一种人工授精用制剂，含有[1]或[2]所述的精子活化剂和精液。[10]一种人工授精用制剂，是将[1]或[2]所述的精子活化剂和精液的混合物填充于容器而成的。[11]一种人工授精用制剂，含有[1]或[2]所述的精子活化剂的第1组合物和含有精液的第2组合物存在于同一容器内，该第1组合物和该第2组合物在该容器内以不同的分区的形式存在。[12]一种人工授精方法，其特征在于，将精子与[1]～[6]中任一项所述的精子活化剂一起注入非人哺乳动物的子宫。[13]根据[12]所述的人工授精方法，其中，所述精子为性别分选精液。[14]一种方法，通过[12]或[13]所述的人工授精方法而生产受精卵。[15]一种受精卵，是通过[12]或[13]所述的人工授精方法而生产的。[16]一种体外受精方法，其特征在于，在[1]～[7]中任一项所述的精子活化剂的存在下，使精子与卵子在生物体外共存。[17]一种体外受精方法，其特征在于，使利用[1]～[7]中任一项所述的精子活化剂进行了处理的精子与卵子在生物体外共存。[18]一种精子活化方法，包括以下的步骤(1)：(1)在[1]～[7]中任一项所述的精子活化剂的存在下培养精子的步骤。[19]根据[18]所述的精子活化方法，进一步包括以下的步骤(2)：(2)回收培养后的精子的步骤。附图说明图1为牛的受精卵移植的概要。图2为培养试验中使用的培养皿的示意图。cont1：精液20μl+PBS3μl、cont2：精液20μl+PBS6μl、1/100：精液20μl+ASC滤液3μl、1/50：精液20μl+ASC滤液6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种精子活化剂，选自来源于脂肪组织的干细胞、来源于牙髓的干细胞、来源于骨髓的干细胞以及来源于脐带血的干细胞中的一种以上的细胞的破碎物为有效成分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.24 JP 2016-1641591.一种精子活化剂，选自来源于脂肪组织的干细胞、来源于牙髓的干细胞、来源于骨髓的干细胞以及来源于脐带血的干细胞中的一种以上的细胞的破碎物为有效成分。2.根据权利要求1所述的精子活化剂，其中，含有以下的(a)～(d)中的任一种，(a)冷冻状态的细胞，(b)将细胞进行破碎处理而得到的破碎液，(c)将(b)的破碎液进行离心处理而得到的上清液，(d)将(b)的破碎液或(c)的上清液进行过滤器处理而得到的滤液。3.根据权利要求1或2所述的精子活化剂，使用于人工授精。4.根据权利要求1～3中任一项所述的精子活化剂，其中，通过精子活化剂活化的精子的生物种与所述细胞的生物种相同。5.根据权利要求1～4中任一项所述的精子活化剂，其中，所述细胞的生物种为非人哺乳动物。6.根据权利要求5所述的精子活化剂，其中，所述非人哺乳动物为牛、猪、马、山羊或绵羊。7.根据权利要求1～4中任一项所述的精子活化剂，其中，所述细胞的生物种为人。8.一种人工授精用制剂，是将权利要求1或2所述的精子活化剂填充于容器而成的。9.一种人工授精用制剂，含有权利要求1或2所述的精子活...

【专利技术属性】
技术研发人员：山本德则，铃木哲，舟桥康人，松川宜久，后藤百万，北山智广，星野洋一郎，村濑哲磨，
申请(专利权)人：国立大学法人名古屋大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP