一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法及其应用技术

一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法及其应用，所述提取方法包括：选取细胞活力较强的第三代人脐带间充质干细胞作为分泌因子来源，于培养瓶中培养第三代人脐带间充质干细胞；待细胞融合度达到80％以上时，吸去培养上清液，使用PBS液清洗两次，更换为无血清培养基；培养48小时后收集上清液，用0.22μm的滤膜过滤，将上清液倒入90mm无菌培养皿中，放入冻干箱内预冻；当温度降至‑40℃，培养液预冻完毕，抽真空使气压压强下降至100Pa以下，升高温度升至‑36℃，开始冷冻干燥，持续约24h后收集冻干粉末，于‑80℃保存。

【技术实现步骤摘要】
一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法及其应用
本专利技术属于医药领域，具体涉一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取，以及该人脐带间充质干细胞分泌因子在抑制骨髓干细胞衰老方面的应用。
技术介绍
我国已经逐渐步入老龄化社会，而且社会老龄化趋势日益加重，随着老龄群体在人群中所占比例的增加，由于衰老所导致的各种疾病的比例也明显升高，包括心血管疾病，阿尔茨海默病，帕金森病以及骨质疏松症，骨关节炎等，而这些病的发生与组织中干细胞的衰老及功能的丧失有着直接的关系。例如老年性骨质疏松症就是一种由于干细胞衰老所导致的疾病。骨质疏松症发生的原因主要是因为成骨量的减少，骨微观结构的改变，造成这种改变的原因主要是因为骨髓间充质干细胞的活性降低，干细胞衰老，增殖分化能力下降，其定向分化为成骨细胞的能力降低，成脂分化能力增强，于此同时骨髓间充质干细胞周围的促进成骨分化的细胞因子，营养因子等微环境改变，骨矿物质基质减少，最终骨量减少，骨骼微结构异常，强度下降。因此补充健康骨髓间充质干细胞，或重新激活加强骨髓间充质干细胞成骨分化能力，增加成骨细胞活性和数量，将成为治疗骨质疏松症，促进局部成骨能力增加，提高骨强度，加速骨形成的新方向。人脐带间充质干细胞(HumanUmbilicalCordMesenchymalStemCells，HUCMSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有来源丰富，易于采集、保存和运输，免疫原性低、避免伦理争议等优点，而且相关文献报道人脐带间充质干细胞可通过旁分泌机制分泌多种分泌因子(SecretionFactors,SF),这些分泌因子具有修复衰老损伤细胞，恢复其增殖分化能力，促进干细胞分化等功能。因此，本领域中提取能够实现对衰老骨髓干细胞起到恢复活力，促进成骨分化作用的人脐带间充质干细胞分泌因子，以及利用该分泌因子制备的促进骨质疏松部位骨再生的药物是本领域中的新的技术研发方向。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法，并根据该方法所提取的分泌因子制备用于实现促进骨质疏松部位骨再生的药物。根据本专利技术所述的要解决的技术问题，本专利技术的内容包括如下方面。一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法，所述方法包括如下步骤：步骤A，选取细胞活力较强的第三代人脐带间充质干细胞作为分泌因子来源，为了大量获得分泌因子，于75cm2培养瓶中培养第三代人脐带间充质干细胞；步骤B，待细胞融合度达到80％以上时，吸去培养上清液，使用PBS液清洗两次，更换为无血清培养基；步骤C，培养48小时后收集上清液，用0.22μm的滤膜过滤，将上清液倒入90mm无菌培养皿中，放入冻干箱内预冻；步骤D，当温度降至-40℃，培养液预冻完毕，抽真空使气压压强下降至100Pa以下，升高温度升至-36℃，开始冷冻干燥；步骤E，持续约24h后收集冻干粉末，于-80℃保存。一种用于实现对促进骨质疏松部位骨再生药物的制备方法，所述方法包括如下步骤：步骤A，将丝素蛋白粉溶解在去离子水中，最终浓度为5.0％(w/v)，将Branson450声波发生器探头伸入液面下，在30％振幅条件下持续作用30秒，30分钟后再次重复此过程；步骤B，待丝素蛋白溶液冷却至室温加入分泌因子冻干粉末，混合均匀，将复合体吸入1毫升注射器内，放置于37℃环境中8小时待其逐渐成胶。一种用于检测含有人脐带间充质干细胞分泌因子药物对促进骨质疏松部位骨再生效果的实验方法：所述实验方法包含如下步骤：将实验生物进行分为年轻组、衰老组、分泌因子组、凝胶组和复合体组，其中年轻组实验生物为3个月龄；衰老组、分泌因子组、凝胶组和复合体组实验生物选择15月龄；对年轻组实验生物的骨质疏松部位注射PBS；对衰老组实验生物的骨质疏松部位注射PBS；对分泌因子组实验生物的骨质疏松部位注射分泌因子溶液；对凝胶组实验生物的骨质疏松部位注射丝素蛋白凝胶；对复合体组实验生物的骨质疏松部位注射含有分泌因子的丝素蛋白凝胶；上述所有组合实验生物，在注射8周后取局部骨组织进行Micro-CT及马松染色观察骨微观结构，收集的数据并进行骨密度、骨小梁体积、骨小梁厚度、骨小梁数目检测。本专利技术的优点在于：根据本专利技术的人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法所制备的分泌因子能够实现恢复衰老骨髓干细胞活力，有效降低骨髓干细胞内活性氧水平，提高骨髓干细胞成骨分化，抑制成脂分化。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例共同用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为本专利技术一实施例的人脐带间充质干细胞分泌因子提取流程示意图；图2为本专利技术一实施例的骨髓间充质干细胞增殖活力对比图；图3为本专利技术一实施例的骨髓间充质干细胞内衰老细胞β-半乳糖苷酶染色结果对比图；图4为本专利技术一实施例的骨髓间充质干细胞内衰老细胞β-半乳糖苷酶阳性率对比图；图5为本专利技术一实施例的骨髓间充质干细胞内活性氧水平荧光强度对比图；图6为本专利技术一实施例的骨髓间充质干细胞内活性氧水平DCF阳性率对比图；图7为本专利技术一实施例的骨髓间充质干细胞钙盐形成量对比图；图8为本专利技术一实施例的骨髓间充质干细胞成骨分化能力对比图；图9为本专利技术一实施例的骨髓间充质干细胞脂肪形成量对比图；图10为本专利技术一实施例的骨髓间充质干细胞成脂分化能力对比图；图11为本专利技术一实施例的不同实验组大鼠骨骼情况对比图；图12为本专利技术一实施例的不同实验组大鼠骨骼骨密度、骨小梁体积、骨小梁厚度、骨小梁数目数据对比图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术实施方式做进一步阐述。实施例1本实施例中人脐带带间充质干细胞分泌因子的提取过程如下所述：步骤A，选取细胞活力较强的第三代人脐带间充质干细胞作为分泌因子来源，为了大量获得分泌因子，于75cm2培养瓶中培养第三代人脐带间充质干细胞；步骤B，待细胞融合度达到80％以上时，吸去培养上清液，使用PBS液清洗两次，更换为无血清培养基；步骤C，培养48小时后收集上清液，用0.22μm的滤膜过滤，将上清液倒入90mm无菌培养皿中，放入冻干箱内预冻；步骤D，当温度降至-40℃，培养液预冻完毕，抽真空使气压压强下降至100Pa以下，升高温度升至-36℃，开始冷冻干燥；步骤E，持续约24h后收集冻干粉末，于-80℃保存。本实施例中人脐带间充质干细胞分泌因子对骨髓间充质干细胞增殖活力影响的实验结果如下：分组情况：提取3月龄及15月龄大鼠BMSCs，并根据其月龄分为年轻BMSCs对照组(Y-C)；衰老BMSCs对照组(O-C)，衰老BMSCs治疗组(O-T)，根据培养基中分泌因子浓度的不同可分为1μg/ml组、50μg/ml组、100μg/ml组、150μg/ml组、200μg/ml组。将BMSCs以每孔2×103个接种到96孔板上，待细胞长满后，更换为加入分泌因子的培养基，浓度分别为1、50、100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml培养5天，利用MTT试剂对各组BMSC培养基行细胞活力检测。结果如图2所示：横坐标为分组情况，纵坐标为细胞活力，以各组的吸光度OD值来表示，与年轻细胞组相比，衰老细胞在增殖活力方面下降了约42％，但是通过在衰老细胞中加入分泌因子，细胞活力有明显提升，而且随着分泌因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤A，选取细胞活力较强的第三代人脐带间充质干细胞作为分泌因子来源，为了大量获得分泌因子，于75cm2培养瓶中培养第三代人脐带间充质干细胞；步骤B，待细胞融合度达到80％以上时，吸去培养上清液，使用PBS液清洗两次，更换为无血清培养基；步骤C，培养48小时后收集上清液，用0.22μm的滤膜过滤，将上清液倒入90mm无菌培养皿中，放入冻干箱内预冻；步骤D，当温度降至‑40℃，培养液预冻完毕，抽真空使气压压强下降至100Pa以下，升高温度升至‑36℃，开始冷冻干燥；步骤E，持续约24h后收集冻干粉末，于‑80℃保存。

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤A，选取细胞活力较强的第三代人脐带间充质干细胞作为分泌因子来源，为了大量获得分泌因子，于75cm2培养瓶中培养第三代人脐带间充质干细胞；步骤B，待细胞融合度达到80％以上时，吸去培养上清液，使用PBS液清洗两次，更换为无血清培养基；步骤C，培养48小时后收集上清液，用0.22μm的滤膜过滤，将上清液倒入90mm无菌培养皿中，放入冻干箱内预冻；步骤D，当温度降至-40℃，培养液预冻完毕，抽真空使气压压强下降至100Pa以下，升高温度升至-36℃，开始冷冻干燥；步骤E，持续约24h后收集冻干粉末，于-80℃保存。2.一种实现对骨髓干细胞起到恢复活力及促进成骨分化的药物，其特征在于，该药物由权利要求1所述的制备方法制备。3.一种用于实现促进骨质疏松部位骨再生的药物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤A，将丝素蛋白粉溶解在去离子水中，得到浓度为5.0％(w/v)的预混液，将Branson450声波发生器...

【专利技术属性】
技术研发人员：王岩松，梁敏，
申请(专利权)人：王岩松，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23