一种暗褐网柄牛肝菌菌株高效驯化培育方法技术

本发明专利技术公开了一种暗褐网柄牛肝菌菌株高效驯化培育方法，属于微生物技术领域，包括以下步骤：(1)采集暗褐网柄牛肝菌子实体；(2)收集担孢子；(3)孢子悬浮液预处理；(4)萌发担孢子，得到单孢菌株；(5)培养所述单孢菌株，得到待筛选的融合菌株；(6)培养所述融合菌株，然后筛选出优势菌株；(7)培养所述优势菌株，然后冷藏保存；本发明专利技术通过驯化、筛选提高暗褐网柄牛肝菌腐生能力，从而有效提高人工栽培产量和稳定性，本方法驯化获得的菌株，出菇率达到85％以上，子实体成熟率达80％以上，形态完整；本发明专利技术能将目前普遍的生物学效率约20％以内的水平提高到生物学效率在38％以上，最高可达47.5％，且外观、产量性状稳定。

A highly efficient domestication and cultivation method of Boletus obscurus strain

\u672c\u53d1\u660e\u516c\u5f00\u4e86\u4e00\u79cd\u6697\u8910\u7f51\u67c4\u725b\u809d\u83cc\u83cc\u682a\u9ad8\u6548\u9a6f\u5316\u57f9\u80b2\u65b9\u6cd5\uff0c\u5c5e\u4e8e\u5fae\u751f\u7269\u6280\u672f\u9886\u57df\uff0c\u5305\u62ec\u4ee5\u4e0b\u6b65\u9aa4\uff1a(1)\u91c7\u96c6\u6697\u8910\u7f51\u67c4\u725b\u809d\u83cc\u5b50\u5b9e\u4f53\uff1b(2)\u6536\u96c6\u62c5\u5b62\u5b50\uff1b(3)\u5b62\u5b50\u60ac\u6d6e\u6db2\u9884\u5904\u7406\uff1b(4)\u840c\u53d1\u62c5\u5b62\u5b50\uff0c\u5f97\u5230\u5355\u5b62\u83cc\u682a\uff1b(5)\u57f9\u517b\u6240\u8ff0\u5355\u5b62\u83cc\u682a\uff0c\u5f97\u5230\u5f85\u7b5b\u9009\u7684\u878d\u5408\u83cc\u682a\uff1b(6)\u57f9\u517b\u6240\u8ff0\u878d\u5408 The method can effectively improve the yield and stability of artificial cultivation by domesticating and screening. The domesticated strains can yield more than 85% of the mushroom and mature more than 80% of the fruiting body, and have complete morphology. The biological efficiency of the whole plant was increased to over 38% within 20%, and the highest was 47.5%. The appearance and yield traits were stable.

【技术实现步骤摘要】
一种暗褐网柄牛肝菌菌株高效驯化培育方法
本专利技术涉及微生物
，尤其涉及一种暗褐网柄牛肝菌菌株高效驯化培育方法。
技术介绍
暗褐网柄牛肝菌(Phlebopusportentosus)，又名异样脉柄牛肝菌，或怪形褐圆孔牛肝菌，俗称黑牛肝菌，隶属于牛肝菌目Boletales，小牛肝菌科Boletinellaceae，脉柄牛肝菌属Phlebopus；主要分布于泛热带地区，包括我国的云南、四川、广西、海南等地，国外的泰国、斯里兰卡、越南、印度尼西亚、澳大利亚、新西兰、非洲、墨西哥等地。暗褐网柄牛肝菌俗名“黑牛肝菌”，其味道鲜美、营养丰富，是云南南部及泰国北部最受欢迎的野生食用菌之一。暗褐网柄牛肝菌属于高蛋白、低脂肪食品，富含各种矿质元素，具有较强的还原能力、抗脂质过氧化作用、清除自由基能力及抑制S-180肉瘤、抗流感，防治感冒作用，是较好的健康食品，具有很好的食、药用价值，深受消费者喜爱。Sanmee等对产自泰国北部的暗褐网柄牛肝菌子实体的营养价值进行分析，蛋白质、脂肪、粗纤维、总糖、灰分的含量分别为24.2％、2.8％、8.8％、46.4％、17.8％，大量元素P、K、S、Ca、Mg的含量分别为8.1、33.3、2.6、0.3、1.2mg/g，微量元素Fe、Zn、Mn、Cu、B的含量分别为2422、93.2、139、63.7、2.2mg/kg。暗褐网柄牛肝菌主要在凤凰木、菠萝蜜树、咖啡树、柚子树、竹林和橡胶树等林下发生，每年的5-9月是其盛产的季节。暗褐网柄牛肝菌子实体单生或丛生，菌盖直径5.0-27.5cm，橄榄褐色，幼时内卷，成熟后平展而中部有浅凹，表面光滑，无光泽。菌肉厚2.0-6.0cm，有微酸味，松软，海绵质，淡黄色，伤后呈蓝绿色。菌管长6.0-15.0mm，幼时污黄色至黄褐色，成熟后橄榄褐色。菌孔刚生长时与菌管同色，成熟后颜色变深，孔径0.5-0.75mm，孔口近圆形，基柄处初贴生，后下陷，菌管髓菌丝平行列。菌柄粗壮，基部往往膨大，(4.0-9.0)cm×(3.0-5.0)cm，与菌盖同色。孢子印橄榄褐色，在显微镜下观察孢子深黄色，短椭圆形，倒卵形或倒梨形，(6.5-13.0)μm×(4.0-7.2)μm。担子长棒状，(37.0-40.0)μm×(6.0-8.0)μm。暗褐网柄牛肝菌也是目前已知的唯一能够实现人工菇房栽培的可食用牛肝菌。暗褐网柄牛肝菌担孢子、菌丝体在实验室条件下能够萌发、生长、交配，在菇房中经过约3个月时间的培养，能够完成整个生活史，形成子实体。关于暗褐网柄牛肝菌的人工栽培技术，现有技术已经有很多报道。比如，国内的云南省热带作物科学研究所，其实现了云南暗褐网柄牛肝菌的人工仿生栽培产业化。暗褐网柄牛肝菌菌丝可以利用的碳源有葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、麦芽提取物、可溶性淀粉等，可以利用的氮源有酵母提取物、蛋白胨及一些铵盐、硝酸盐，不能利用尿素。普遍认为最适合菌丝生长的碳源和氮源分别是葡萄糖和酵母提取物，有报道显示碳氮比10∶1的麦芽提取物和酵母提取物是其生长最适的培养基，Kumla等却认为蛋白胨和NH4H2PO4是促进菌丝生长最好的氮源。另外添加适量VB1、KH2PO4和MgSO4有利于菌丝的生长。暗褐网柄牛肝菌菌丝能够适应pH3-9的环境。暗褐网柄牛肝菌菌丝能够生长的温度在10-40℃，40℃时菌丝会死亡，而10℃以下菌丝不能生长，最适培养温度28-30℃。高锋等通过对菌丝生长状况，分泌淀粉酶的能力，可溶性蛋白和酯酶同工酶及出菇性状等的研究，推断暗褐网柄牛肝菌菌种继代不宜超过两次。暗褐网柄牛肝菌母种直接转接到原种培养基中生长缓慢，液体发酵成为扩大菌种最主要的方式之一。王文兵等采用摇瓶法对碳源、氮源、发酵条件等进行研究，筛选出适合暗褐网柄牛肝菌生长的最佳碳源为甘露醇，最佳氮源为酵母膏，培养温度为28℃，震荡速度为130r/min，培养周期10d。野生暗褐网柄牛肝菌的生长与植物的关系十分密切。其菌丝和菌索生长在这些植物的根系周围和根的表面，而且在大多数植物根系上形成菌腔虫瘿。野生暗褐网柄牛肝菌虽然在没有植物的参与下也可以产生子实体，但发生效率很低。但是，目前的菇房人工栽培方法，存在单位产量较低的问题，一般生物学效率仅约20％以内，比如中国专利申请号200910094157.4公开了培养50天固体菌种的菌丝体长满700ml培养基，该专利报道的菌丝和子实体(鲜菇)价值差距巨大，菌丝不具商品性。而且，出菇不稳定的问题，需要对暗褐网柄牛肝菌进行驯化。中国专利申请号201410413765.8公开了一种驯化方法，该方法将性状优良的黑牛肝菌子实体作为驯化菌株，将驯化菌株的菌肉组织接种在营养瘠薄型基质，得到牛肝菌菌丝，使牛肝菌菌丝在富含木质素、C、N营养瘠薄型基质中反复进行菌丝腐生能力诱导、驯化，诱发黑牛肝菌对木质素、纤维素的分解利用能力，增强黑牛肝菌分解利用木质素、纤维素的能力，提高抗杂能力，从而提高出菇率、出菇整齐度和成熟率，提高了黑牛肝菌栽培的生物学效率，得到的黑牛肝菌性状优良，该专利也是基于子实体组织分离驯化而来的菌株，其遗传性状较固定，但是，其生物学效率最高仅为22％。又比如中国专利申请号200910094157.4公开了一种暗褐网柄牛肝菌培养方法，该方法实现了从母种、液体菌种到固体菌种的快速培养；该专利报道基本基于子实体组织分离驯化而来的菌株，其遗传性状较固定。所以，在单位产量、出菇稳定性等方面，还有很多的改善空间。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于提供一种暗褐网柄牛肝菌菌株高效驯化培育方法，以解决上述问题。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是这样的：一种暗褐网柄牛肝菌菌株高效驯化培育方法，包括以下步骤：(1)采集暗褐网柄牛肝菌子实体；优选采用生长健康、性状优良的暗褐网柄牛肝菌子实体；并且，暗褐网柄牛肝菌子实体可以是野生的，也可以是人工栽培的；(2)收集担孢子；(3)孢子悬浮液预处理；(4)萌发担孢子，得到单孢菌株；(5)培养所述单孢菌株，得到待筛选的融合菌株；(6)培养所述融合菌株，然后筛选出优势菌株；(7)培养所述优势菌株，然后冷藏保存。作为优选的技术方案：步骤(7)后，每三个月继代培养一次。作为优选的技术方案，所述步骤(2)的方法为：将步骤(1)采集的暗褐网柄牛肝菌子实体在无菌条件下选下部分菌盖，粘于预先灭菌的试管口处，置于无菌环境中静置16-48小时，使担孢子自然弹射到试管底部，20-30h后，肉眼可见试管壁上及底部出现褐色担孢子印，取出子实体块，对试管口进行灭菌处理，塞回棉塞，完成担孢子收集。作为优选的技术方案，所述步骤(3)的方法为：将收集担孢子的试管中加入无菌水，制成孢子悬浮液，置于37-45℃培养箱中，培养24-48h。作为优选的技术方案，所述步骤(4)的方法为：将经过步骤(3)预处理过的孢子悬浮液梯度稀释至10、100、1000倍，直至显微镜视野中有10-20个担孢子，将其涂布于暗褐网柄牛肝菌担孢子培养基1，置于26-32℃(优选为28℃)培养，至担孢子萌发。作为进一步优选的技术方案，所述培养基1的配置方法为：称取200-300g去皮马铃薯，加水煮沸20-30分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖10.0-25.0g、酵母提取物1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种暗褐网柄牛肝菌菌株高效驯化培育方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集暗褐网柄牛肝菌子实体；(2)收集担孢子；(3)孢子悬浮液预处理；(4)萌发担孢子，得到单孢菌株；(5)培养所述单孢菌株，得到待筛选的融合菌株；(6)培养所述融合菌株，然后筛选出优势菌株；(7)培养所述优势菌株，然后冷藏保存。

【技术特征摘要】
1.一种暗褐网柄牛肝菌菌株高效驯化培育方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集暗褐网柄牛肝菌子实体；(2)收集担孢子；(3)孢子悬浮液预处理；(4)萌发担孢子，得到单孢菌株；(5)培养所述单孢菌株，得到待筛选的融合菌株；(6)培养所述融合菌株，然后筛选出优势菌株；(7)培养所述优势菌株，然后冷藏保存。2.根据权利要求1所述的暗褐网柄牛肝菌驯化方法，其特征在于：步骤(7)后，每三个月继代培养一次。3.根据权利要求1所述的暗褐网柄牛肝菌驯化方法，其特征在于，所述步骤(2)的方法为：将步骤(1)采集的暗褐网柄牛肝菌子实体在无菌条件下选下部分菌盖，粘于预先灭菌的试管口处，置于无菌环境中静置16-48小时，使担孢子自然弹射到试管底部，20-30h后，肉眼可见试管壁上及底部出现褐色担孢子印，取出子实体块，对试管口进行灭菌处理，塞回棉塞，完成担孢子收集。4.根据权利要求1所述的暗褐网柄牛肝菌驯化方法，其特征在于，所述步骤(3)的方法为：将收集担孢子的试管中加入无菌水，制成孢子悬浮液，置于37-45℃培养箱中，培养24-48h。5.根据权利要求1所述的暗褐网柄牛肝菌驯化方法，其特征在于，所述步骤(4)的方法为：将经过步骤(3)预处理过的孢子悬浮液梯度稀释至10、100、1000倍，直至显微镜视野中有10-20个担孢子，将其涂布于暗褐网柄牛肝菌担孢子培养基1，置于26-32℃培养，至担孢子萌发。6.根据权利要求5所述的暗褐网柄牛肝菌驯化方法，其特征在于，所述培养基1的配置方法为：称取200-300g去皮马铃薯，加水煮沸20-30分钟后，纱布过滤得马铃薯浸出液，然后加入葡萄糖10.0-25.0g、酵母提取物1.0-2.5g、NH4N030.5-2.0g、MgCl21.0-3.0g、KCl0.5-1.5g、琼脂20.0-30.0g，加去离子水定容1000mL，pH自然，灭菌；灭菌后，待其冷却...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦小波，樊莉娟，
申请(专利权)人：秦小波，
类型：发明
国别省市：四川,51