利用土曲霉菌株生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸进而合成合成橡苔的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用土曲霉菌株生产4‑O‑去甲基巴尔巴地衣酸进而合成合成橡苔的方法，涉及新菌株、微生物发酵技术及化学合成技术领域，所述土曲霉菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)MEFC06，土曲霉菌种发酵培养；分离纯化得到4‑O‑去甲基巴尔巴地衣酸，将4‑O‑去甲基巴尔巴地衣酸水解为2,4‑二羟基‑3,6‑二甲基苯甲酸；采用甲基化试剂进行甲酯化反应，反应结束后处理即可得到2,4‑二羟基‑3,6‑二甲基苯甲酸甲酯(合成橡苔)。提供了新的微生物发酵与化学合成相结合来生产合成橡苔的方法，绿色生态，合成路线短，工艺简单，产量高。

Method of synthesizing rubber moss from 4-O-demethylbarba lichenic acid produced by Aspergillus terrestris strain

The invention discloses a method for synthesizing rubber moss by using Aspergillus terreus strain to produce 4_O_demethylbarbarlic acid, which involves the fields of new strains, microbial fermentation technology and chemical synthesis technology. The Aspergillus terreus strain is Aspergillus terreus MEFC06 and Aspergillus terreus strain is fermented and cultured; 4_O_demethylbarlic acid is isolated and purified, and 4_O_O_terreus lichenic acid is synthesized. 2,4-dihydroxy-3,6-dimethylbenzoic acid was hydrolyzed to 2,4-dihydroxy-3,6-dimethylbenzoic acid by acid hydrolysis of demethylbarba lichen; methyl esterification was carried out by methylation reagent, and 2,4-dihydroxy-3,6-dimethylbenzoic acid methyl ester (synthetic rubber moss) was obtained after treatment. A new method of synthesizing oak moss by microbial fermentation combined with chemical synthesis is provided. It is green, ecological, short synthetic route, simple process and high yield.

【技术实现步骤摘要】
利用土曲霉菌株生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸进而合成合成橡苔的方法
本专利技术涉及新菌株、微生物发酵技术及化学合成
，具体涉及一种利用土曲霉菌株生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸进而合成合成橡苔的方法。
技术介绍
橡苔是一种稀有的地衣资源，一般指生长在橡树树干和枝条上的松萝科扁枝衣属的栎扁枝衣，橡苔浸膏和精油被广泛应用于香水、护肤品、香烟和熏香等日用品，同时，橡苔也作为食品添加剂应用于饮料、烘焙食品、布丁、软糖等。天然橡苔主要产自于欧洲中南部和北非一代地中海沿岸国家，如法国、意大利等。我国橡苔资源极其稀少，仅在云南开发了橡苔I号和II号，由于地衣原料不同使得香气有很大的区别，主要作为烟草香精使用。橡苔浸膏和精油作为一种天然产物制品，其市场和应用存在一些先天不足。首先，天然橡苔资源稀缺，售价高昂。其次，由于原料来源、提取工艺的差异使得橡苔品质不一，而且企业为降低成本会对产品进行调配，使得市场混乱。另外，天然橡苔浸膏和精油是一种混合物，成分复杂，其中部分化合物已被认定为过敏原，欧盟化妆品法规对这些致敏原物质的使用作出了规定和限制。上述不利因素都限制了橡苔的市场应用，因此，鉴定天然橡苔的主要呈香化合物并开发其生产工艺受到了企业和科研人员的关注。研究表明2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯(1CAS:4707-47-5)是橡苔中的主香化合物，因此该化合物被称为合成橡苔。关于合成橡苔的化学合成路线已经有文献和专利报道，其中大部分合成路线中都是以不同原料合成关键中间体2,5-二甲基间苯二酚(2CAS:488-87-9)和2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸(3CAS:4707-46-4)最后生成2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯，制备过程如图1所示。但是，在实际生产中，这两个关键中间体的制备工艺复杂，并且收率较低、成本较高，因此采用化学方法生产合成橡苔的方法在实际应用中存在一定的缺陷，限制了合成橡苔市场的发展。
技术实现思路
为解决上述化学方法生产合成橡苔的方法在实际应用中存在的问题，本专利技术提供一种产生4-O-去甲基巴尔巴地衣酸(CAS:20372-89-8)的土曲霉菌株、该菌株在发酵生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸中的应用，及利用上述土曲霉菌株发酵生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸进而合成2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯的方法，同时还提供了利用4-O-去甲基巴尔巴地衣酸合成2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯(即合成橡苔)的方法。首先，本专利技术提供一种产生4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的土曲霉菌株，所述土曲霉菌株为土曲霉(Aspergillusterreus)MEFC06，已于2018年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为：CGMCCNo.15890。第二，本专利技术提供上述产生4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的土曲霉菌株在发酵生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸中的应用，包括以下步骤：(1)土曲霉种子液的制备，种子液接种到发酵培养基中发酵培养；(2)发酵液分离纯化得到4-O-去甲基巴尔巴地衣酸。步骤(1)中所述种子液的制备，具体为：将土曲霉MEFC06接种到PDA平板培养基上，28℃培养2-9天，将平板上的孢子接种到种子培养基中，接种量为106-108个/35mL，28℃、220rpm摇床培养培养1-5天，得到种子液。步骤(1)中种子液接种到发酵培养基的接种量为按二者体积比3:35。步骤(1)中所述发酵培养，发酵温度为28℃，220rpm摇床培养6-12天，并在第4天向发酵培养体系中补加质量分数50％葡糖糖溶液，原发酵体系体积为补加的葡萄糖溶液体积的9倍。步骤(2)中所述分离提纯，具体为：菌体与发酵液分别用不同的有机溶剂萃取，合并所有有机相，浓缩有机相获得粗提物，粗提物采用硅胶柱层析分离得到洗脱液，洗脱液重结晶得到4-O-去甲基巴尔巴地衣酸。所述将菌体与发酵液分离的方法为：采用200目的尼龙布过滤，取滤液为发酵液，取滤渣为菌体。所述菌体萃取为：菌体用二氯甲烷/甲醇混合有机溶剂浸泡，超声萃取，分离有机相，剩余菌体重复上述操作两次，合并有机相；所述二氯甲烷/甲醇混合有机溶剂中，二氯甲烷与甲醇的体积比为1:1；所述超声萃取，超声频率为40kHz-100kHz，每次超声萃取时间为1-30min；每次超声萃取，混合有机溶剂与菌体的比例为(5-500)mL:(1-5)g。所述发酵液萃取为：菌液与乙酸乙酯混匀，静置分层，分离有机相，剩余水相重复上述操作两次，合并有机相。所述浓缩有机相，为减压蒸馏浓缩，温度为60℃以下。浓缩获得粗提物的体积为原有机相总体积的1％-90％。所述硅胶柱层析具体为：粗提物与硅胶按质量比1:(5-10)拌样，然后与200-300目的硅胶按高度比1:(3-5)装柱过减压硅胶柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯：石油醚体积比1:9，洗脱剂中含有0.1％(体积分数)的甲酸或三氟乙酸，洗脱量为3-5个柱体积，洗脱剂流速为5-20ml/min。所述重结晶具体为：洗脱液在40℃条件下减压蒸馏浓缩至过饱和状态，冰浴冷却，结晶后过滤，滤饼用二氯甲烷冲洗3-4次，30℃干燥。第三，本专利技术还提供一种利用4-O-去甲基巴尔巴地衣酸合成2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯的方法，技术方案为：1)4-O-去甲基巴尔巴地酸通过酸水解或碱水解的方法获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸；2)2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸通过甲酯化反应获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯。以上技术方案具体为：1)将4-O-去甲基巴尔巴地衣酸溶于浓硫酸得到反应体系，水浴中搅拌反应，反应结束后猝灭反应，乙酸乙酯萃取，收集有机相减压浓缩，干燥后获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸；2)2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸与KHCO3共同溶于DMF中，氮气保护条件下加热搅拌，搅拌后，在相同温度下缓慢滴加CH3I，继续搅拌发生反应，反应结束后猝灭反应，乙酸乙酯萃取，收集有机相，有机相采用饱和NaCl水溶液清洗，减压浓缩所得有机相，干燥获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯。步骤1)所述浓硫酸为质量分数95％-98％的硫酸水溶液。步骤1)所述4-O-去甲基巴尔巴地衣酸与浓硫酸的比例为0.22g/mL。所述水浴温度为26℃，水浴中搅拌反应时间为10-40min。所述猝灭反应的方法为在反应体系中加入冰水，冰水体积为反应体系体积的5倍。所述乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯体积为反应体系体积的5倍，萃取3次后合并有机相。所述减压浓缩，温度为60℃以下，浓缩至剩余体积为1-20mL。所述干燥为30-50℃条件下烘干。步骤2)所述2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸与KHCO3的物质的量之比为9.2:13.8，2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸与DMF的比例为0.084g/mL。所述加热搅拌，温度为40℃，搅拌时间为10min。2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸与CH3I的物质的量之比为9.2:9.5。所述反应时间为85-120min。所述猝灭反应的方法为在反应体系中加入冰水，冰水体积为反应体系体积的5倍。所述乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯体积为反应体系体积的5倍，萃取3次后合并有机相。所述饱和NaCl水溶液清洗，每次本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用土曲霉菌株生产4‑O‑去甲基巴尔巴地衣酸进而合成合成橡苔的方法，其特征在于：包括以下步骤：一、土曲霉种子液制备，种子液接种到发酵培养基中发酵培养；二、发酵液分离纯化得到4‑O‑去甲基巴尔巴地衣酸；三、4‑O‑去甲基巴尔巴地酸通过酸水解或碱水解的方法获得2,4‑二羟基‑3,6‑二甲基苯甲酸；四、2,4‑二羟基‑3,6‑二甲基苯甲酸通过甲酯化反应获得2,4‑二羟基‑3,6‑二甲基苯甲酸甲酯。

【技术特征摘要】
1.一种利用土曲霉菌株生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸进而合成合成橡苔的方法，其特征在于：包括以下步骤：一、土曲霉种子液制备，种子液接种到发酵培养基中发酵培养；二、发酵液分离纯化得到4-O-去甲基巴尔巴地衣酸；三、4-O-去甲基巴尔巴地酸通过酸水解或碱水解的方法获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸；四、2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸通过甲酯化反应获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯。2.根据权利要求1所述的利用土曲霉菌株生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸进而合成合成橡苔的方法，其特征在于：所述步骤三具体为：将4-O-去甲基巴尔巴地衣酸溶于浓硫酸得到反应体系，水浴中搅拌反应，反应结束后猝灭反应，乙酸乙酯萃取，收集有机相减压浓缩，干燥后获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸；所述步骤四具体为：2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸与KHCO3共同溶于DMF中，氮气保护条件下加热搅拌，搅拌后，在相同温度下缓慢滴加CH3I，继续搅拌发生反应，反应结束后猝灭反应，乙酸乙酯萃取，收集有机相，有机相采用饱和NaCl水溶液清洗，减压浓缩所得有机相，干燥获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯。3.根据权利要求1所述的利用土曲霉菌株生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸进而合成合成橡苔的方法，其特征在于：所述土曲霉菌株为土曲霉(Aspergillusterreus)MEFC06，已于2018年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为：CGMCCNo.15890；步骤一中所述种子液制备，具体为：将土曲霉MEFC06接种到PDA平板培养基上，28℃培养4-9天；将PDA平板培养基上的土曲霉孢子接种到种子培养基中，28℃、220rpm摇床培养培养1-5天，得到种子液，接种量为106-108个/35mL。4.根据权利要求1所述的利用土曲霉菌株生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸进而合成合成橡苔的方法，其特征在于：步骤一中种子液接种到发酵培养基的接种量为按二者体积比3:35；步骤一中所述发酵培养，发酵温度为28℃，220rpm摇床培养6-12天，并在第4天向发酵培养体系中补加质量分数50％葡糖糖溶液，原发酵体系体积为补加的葡萄糖溶液体积的9倍。5.根据权利要求1所述的利用土曲霉菌株生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸进而合成合成橡苔的方法，其特征在于：步骤二中所述分离提纯，具体为：菌体与...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕雪峰，黄雪年，张伟，李鸿成，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37