The invention proposes a new kit for detecting mutation of Braf V600E locus, which uses two-phase enzymatic system RNase H2 and DNA polymerase technology. Because of the double-enzyme system amplification method, it has been changed on the basis of common primers, i.e., the 3'end of primer sequence SEQ ID NO.1 is connected with spacer arm x, so that the primers can specifically bind to template sequence and bind to RNase. The primers and probes for the mutation site of Braf V600E were designed, and the possibility of late contamination was reduced by using fluorescent PCR and closed detection. The kit provided by the invention has high sensitivity, fast detection, good stability and closed detection, which reduces the possibility of late contamination.
【技术实现步骤摘要】
一种针对BrafV600E位点突变检测的试剂盒
本专利技术涉及分子生物学
,具体涉及一种针对BrafV600E位点突变检测的试剂盒。
技术介绍
BRAF基因位于人类染色体7q34,其功能编码区由2510对碱基组成,编码MAPK通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该酶将信号从RAS转导至MEK1/2,从而参与调控细胞内多种生物学事件。BRAF基因突变在多种恶性肿瘤细胞中都有报道。在结直肠癌(CRC)中,BRAF突变率约为15%左右,这些突变主要发生于编码激活区的外显子15上,其中约92%位于第1799位核苷酸上(1799T>A),导致其编码的缬氨酸被谷氨酸取代(V600E)。除了结直肠癌外,BRAF在恶性黑色素瘤、甲状腺癌、肺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的突变。近年的研究结果提示,对于那些KRAS基因为野生型、但存在BRAF基因V600E(1799T>A)突变的患者,抗EGFR单抗治疗无效。意大利学者DiNicolantonio等的研究发现,KRAS基因无突变、BRAF基因突变阳性的转移性结直肠癌(mCRC)患者对西妥昔单抗或帕尼单抗治疗无反应。值得注意的是,BRAF突变除了是预测性指标(predictivefactor)之外,还是一个预后指标(prognosticfactor),DiNicolantonio等研究结果还显示,BRAF突变的mCRC患者预后不良。因此,2010年版NCCN结直肠癌临床实践指南中已增加相应条目,明确指出如果KRAS基因无突变时,必须检测排除BRAF基因突变,如果后者存在V600E突变,则不应该给予抗EGFR单抗 ...
【技术保护点】
1.一种针对Braf V600E位点基因突变检测的引物组合,其特征在于:所述引物组合包括:引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
【技术特征摘要】
1.一种针对BrafV600E位点基因突变检测的引物组合,其特征在于:所述引物组合包括:引物序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。2.一种针对BrafV600E位点基因突变检测的探针,其特征在于:所述探针包括针对BrafV600E位点基因突变对应的探针序列SEQIDNO.3,序列SEQIDNO.3的5’端标记有荧光基团,3’端标记有淬灭基团。3.如权利要求2所述的一种针对BrafV600E位点基因突变检测的探针,其特征在于:所述SEQIDNO.3探针5’端标记有FAM荧光基团,3’端标记有淬灭基团BHQ1。4.一种针对BrafV600E位点基因突变检测的酶混合液,其特征在于:包括RNaseH2和TaqDNA聚合酶,所述RNaseH2与TaqDNA聚合酶酶活性浓度比为1:50~1:400。5.如权利要求4所述的一种针对BrafV600E位点基因突变检测的酶混合液,其特征在于:所述酶混合液中,RNaseH2与TaqDNA聚合酶酶活性浓度比为1:250。6.一种针对BrafV600E位点基因突变检测的试剂盒,其特征在于:包括权利要求1所述引物序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2、权利要求书2所述探针序列SEQIDNO.3、权利要求4所述酶混合液、PCR缓冲液和4种dNTPs。7.如权利要求6所述的一种针对BrafV600E位点基因突变检测的试剂盒,其特征在于:包括如下试剂:(1)PCR反应预混液:成分包括PCR缓冲液、4种dNTPs、探针序列SEQIDNO.3和通用人源性内标探针、引物由SEQID...
【专利技术属性】
技术研发人员:徐志勇,秦伟,
申请(专利权)人:武汉千麦医学检验所有限公司,
类型:发明
国别省市:湖北,42
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