生物催化丙烯腈水合反应的方法、产腈菌株的灭活方法技术

本发明专利技术公开一种生物催化丙烯腈水合反应的方法，包括以下步骤：步骤一、对诺卡氏菌进行耐受性训练；步骤二、然后经发酵培养、筛选，得到合格发酵液；步骤三、合格发酵液经离心后，去除上清液，清洗得菌液；步骤四、菌液进行灭活处理；步骤五、将灭活后的菌液作为催化剂，催化丙烯腈水合反应。本发明专利技术还公开一种产腈菌株的灭活方法。本发明专利技术具有达到减少副产物丙烯酸的生成量的优点。

Biocatalytic hydration of acrylonitrile and inactivation of nitrile-producing strains

The invention discloses a method for biocatalytic hydration of acrylonitrile, which comprises the following steps: first, training the tolerance of Nocardia; second, obtaining qualified fermentation broth through fermentation culture and screening; third, removing supernatant after centrifugation and cleaning the obtained bacterial broth; fourth, inactivating the bacterial broth; fifth, inactivating the bacterial broth after inactivation; Acrylonitrile hydration was catalyzed by the bacterium liquid as catalyst. The invention also discloses an inactivation method for nitrile-producing strains. The invention has the advantages of reducing the production amount of by-product acrylic acid.

【技术实现步骤摘要】
生物催化丙烯腈水合反应的方法、产腈菌株的灭活方法
本专利技术涉及丙烯酰胺制备
，尤其涉及生物催化丙烯腈水合反应的方法、产腈菌株的灭活方法。
技术介绍
生物法制取丙烯酰胺是将丙烯腈、原料水和固定化生物催化剂调配成水合溶液.催化反应后分离出废催化剂就可得到丙烯酰胺产品。该方法相比其他现有技术如硫酸水合法、催化水合法存在以下优点：操作安全、无副反应、成本低、纯度高。腈水合酶是微生物法生产丙烯酰胺的催化剂，但是在生物法生产丙烯酰胺的生产过程中会同时产生腈水合酶和腈水解酶。其中，腈水合酶是一种组成酶，只受微生物自身的遗传物质决定。而腈水解酶更倾向为一种诱导酶，在微生物催化剂催化水合反应生成丙烯酰胺的过程中，随着丙烯酰胺浓度的提升，微生物受到底物丙烯酰胺的刺激，体内开始合成更多的腈水解酶，腈水解酶会催化部分丙烯酰胺水解成丙烯酸，丙烯酸这种副产物的存在会影响丙烯酰胺溶液产品的质量和储存稳定性，同时也会造成原料丙烯腈的消耗，最终影响了生成液产品的质量和后期储存的稳定性。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术的旨在通过灭活剂对生产菌先进行灭活处理，处理后制备成的生物催化剂催化丙烯腈水合反应，从而达到减少副产物丙烯酸的生成量的技术效果。本专利技术通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：一种生物催化丙烯腈水合反应的方法，包括以下步骤：步骤一、对诺卡氏菌进行耐受性训练；步骤二、然后经发酵培养、筛选，得到合格发酵液；步骤三、合格发酵液经离心后，去除上清液，清洗得菌液；步骤四、菌液进行灭活处理；步骤五、将灭活后的菌液作为催化剂，催化丙烯腈水合反应。优选地，所述步骤一的耐受性训练是用55～60wt％的丙烯酰胺水溶液浸泡菌种16～40h，然后分离纯化、复壮培养。本专利技术利用固体培养基配制的平板，用现有技术的稀释涂布法涂布平板培养达到分离纯化的目的。即将菌液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养4天后挑取单个菌落。利用固体培养基配制的试管培养12天达到复壮培养的目的。优选地，所述步骤二中发酵培养中发酵罐培养的温度为23.5～27.5℃，通入压缩空气流量为210～240m3/h,保持罐内压力为0.05～0.07Mpa，培养时间为55～60h。优选地，所述步骤二中的筛选具体工艺为：取样做酶活力检测，用气相色谱法检测酶活，酶活达到1600～2000μg/mL·h为合格发酵液。优选地，固体培养基包括以下质量份数的原料：葡萄糖0.5～1份、豆粕水解液0.1～0.3份、氯化钠0.05～0.1份、磷酸钾0.01～0.03份、硫酸镁0.01～0.03份、琼脂粉1～3份、水90～95份。优选地，发酵培养基包括以下质量份数的原料：葡萄糖2～3.5份、豆粕水解液0.1～0.3份、尿素0.8～1.0份、磷酸钾0.03～0.05份、硫酸氨0.03～0.05份、谷氨酸钠0.05～0.075份、氯化钴0.0001～0.0005份、水94～95份优选地，所述步骤三中离心的转速为4000r/min、离心时间为15min。优选地，所述步骤四中灭活处理的具体工艺为：加入菌液总体积0.5～1％的灭活剂甲醛，对菌液进行灭活处理，灭活时控制温度30～37℃，灭活时间控制在3～5h；其中所用的灭活剂甲醛为分析纯AR。优选地，所述步骤五中的催化剂、纯水、丙烯腈三者的的质量比为1:240:75。反应过程控制温度21～23℃，水合反应时间为15～16h。本专利技术还公开一种产腈菌株的灭活方法，包括以下步骤：步骤一、对诺卡氏菌进行耐受性训练；步骤二、然后经发酵培养、筛选，得到合格发酵液；步骤三、合格发酵液经离心后，去除上清液，清洗得菌液；步骤四、菌液进行灭活处理。本专利技术的优点在于：本专利技术在菌体作为生物催化剂催化水合反应之前，加入灭活剂预处理，灭活后的菌体再做为生物催化剂催化丙烯腈水合反应，进而达到减少催化反应中副产物丙烯酸的生成量，减少原料丙烯腈的消耗量，副产物丙烯酸含量的降低也会使得丙烯酰胺水溶液产品的电导率低，有利于产品的质量。本专利技术的方法能够将催化反应生成液中的丙烯酸含量降低70％以上，有利于产品质量和储存稳定性。本专利技术对于菌体灭活的控制温度30～37℃，控制时间为3～5h是实现本专利技术的特定参数范围，如果不在这个参数范围内，技术效果达不到本专利技术的技术效果。用灭活剂灭活处理时控制的温度过高，则会直接影响到腈水合酶的活性，使得酶活性降低，因为腈水合酶是一种蛋白质，它有一定的最适温度，实验发现，菌体灭活的控制温度30～37℃，也是该腈水合酶的最适温度，灭活的控制温度低于这个范围，则菌体不能被彻底酶活，本专利技术用甲醛灭活的原理是甲醛进入菌体直接破坏其遗传物质，使菌体丧失遗传功能，这样灭活后菌体就不能再大量合成腈水解酶了，但不会破坏腈水合酶的活性,本专利技术的重要之处就是发现这种灭活剂甲醛对该诺卡式菌的灭活特性和用甲醛灭活该菌种的特定温度。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本专利技术的诺卡氏菌株为现有技术，来源于上海市农药研究所，保存条件为3～4℃，菌株编号为0918C018F3。实施例1本实施例公开一种生物催化丙烯腈水合反应的方法，包括以下步骤：步骤一、对诺卡氏菌用55wt％的丙烯酰胺水溶液浸泡16h，然后分离纯化、复壮培养；利用固体培养基配制的平板，用现有技术的稀释涂布法涂布平板培养达到分离纯化的目的，利用固体培养基配制的试管培养达到复壮培养的目的。固体培养基包括以下质量份数的原料：葡萄糖0.5份、豆粕水解液0.1份、氯化钠0.05份、磷酸钾0.01份、硫酸镁0.01份、琼脂粉1份、水90份。步骤二、然后经发酵培养、筛选，得到合格发酵液；发酵培养中发酵罐培养的温度为27.5℃，通入压缩空气流量为210m3/h,保持罐内压力为0.05Mpa，培养时间为55h。发酵培养基包括以下质量份数的原料：葡萄糖2份、豆粕水解液0.3份、尿素0.5份、磷酸钾0.03份、硫酸氨0.03份、谷氨酸钠0.05份、氯化钴0.0005份、水95份。用气相色谱法检测酶活，取样做酶活力检测，用气相色谱法检测酶活，酶活达到1600μg/mL·h为合格发酵液。步骤三、合格发酵液经纯水洗涤置换、离心去除上清液获得干净的菌液；离心的转速为4000r/min、离心时间为15min。步骤四、加入菌液总体积0.5％的灭活剂甲醛，对菌液进行灭活处理，灭活时控制温度30℃，灭活时间控制在3h；其中所用的灭活剂甲醛为分析纯AR。步骤五、将灭活后的菌液作为催化剂，催化丙烯腈水合反应。催化剂、纯水、丙烯腈三者的的质量比为1:240:75。反应过程控制温度21℃，水合反应时间为15h。实施例2本实施例公开一种生物催化丙烯腈水合反应的方法，包括以下步骤：步骤一、对诺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物催化丙烯腈水合反应的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、对诺卡氏菌进行耐受性训练；步骤二、然后经发酵培养、筛选，得到合格发酵液；步骤三、合格发酵液经离心后，去除上清液，清洗得菌液；步骤四、菌液进行灭活处理；步骤五、将灭活后的菌液作为催化剂，催化丙烯腈水合反应。

【技术特征摘要】
1.一种生物催化丙烯腈水合反应的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、对诺卡氏菌进行耐受性训练；步骤二、然后经发酵培养、筛选，得到合格发酵液；步骤三、合格发酵液经离心后，去除上清液，清洗得菌液；步骤四、菌液进行灭活处理；步骤五、将灭活后的菌液作为催化剂，催化丙烯腈水合反应。2.根据权利要求1所述的生物催化丙烯腈水合反应的方法，其特征在于，所述步骤一的耐受性训练是用55～60wt％的丙烯酰胺水溶液浸泡菌种16～40h，然后分离纯化、复壮培养。3.根据权利要求1所述的生物催化丙烯腈水合反应的方法，其特征在于，所述步骤二中发酵培养中发酵罐培养的温度为23.5～27.5℃，通入压缩空气流量为210～240m3/h,保持罐内压力为0.05～0.07Mpa，培养时间为55～60h。4.根据权利要求1所述的生物催化丙烯腈水合反应的方法，其特征在于，所述步骤二中的筛选具体工艺为：取样做酶活力检测，酶活达到1600～2000μg/mL·h为合格发酵液。5.根据权利要求1所述的生物催化丙烯腈水合反应的方法，其特征在于，所述步骤三中离心的转速为4000r/...

【专利技术属性】
技术研发人员：王林，赵国华，徐强，黄伟，刘艳丽，
申请(专利权)人：安徽巨成精细化工有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34