猪丁型冠状病毒重组N蛋白及其多克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪丁型冠状病毒(PDCoV)重组N蛋白的制备方法，该法对PDCoV的N基因片段进行扩增后经过原核表达、纯化后获得重组N蛋白。据此，发明专利技术人还建立了重组N蛋白多克隆抗体的制备方法，即应用PDCoV重组N蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫动物获得多克隆抗体血清。实验表明，本发明专利技术成功扩增了PDCoV的N基因并进行原核表达及纯化，初步研究其免疫原性，为研制诊断试剂盒或制备多克隆抗体奠定了基础。

Preparation of recombinant N protein of swine T-type coronavirus and preparation of its polyclonal antibody

The invention discloses a preparation method of recombinant N protein of porcine coronavirus D (PDCoV). The method amplifies the N gene fragment of PDCoV and obtains the recombinant N protein after prokaryotic expression and purification. Accordingly, the inventor also established a method for preparing polyclonal antibodies against recombinant N protein, i.e. using PDCoV recombinant N protein emulsified with Freund's adjuvant to immunize animals to obtain polyclonal antibody serum. Experiments show that the N gene of PDCoV has been successfully amplified, expressed and purified in prokaryotic form, and its immunogenicity has been preliminarily studied, which lays a foundation for developing diagnostic kits or preparing polyclonal antibodies.

【技术实现步骤摘要】
猪丁型冠状病毒重组N蛋白及其多克隆抗体的制备方法
本专利技术属于猪丁型冠状病毒
，尤其涉及一种猪丁型冠状病毒重组N蛋白及其多克隆抗体的制备方法。
技术介绍
猪丁型冠状病毒(porcinedeltacoronavirus,PDCoV)最早发现于2012年，香港大学的Woo等从健康的商品猪中检测到猪丁型冠状病毒。冠状病毒分为甲、乙、丙、丁四个亚群，感染猪的丁型冠状病毒(PDCoV)是唯一一种感染非禽类的丁型冠状病毒。此后，在美国、中国、韩国等许多国家相继报道了PDCoV的流行。与PEDV和TGEV类似，PDCoV主要引起猪的肠道疾病，导致感染猪腹泻、呕吐和脱水，发病率和死亡率可高达50％-100％，尤以哺乳阶段仔猪发病最为严重，严重威胁着猪群健康，给养猪业带来了巨大的经济损失。PDCoV全长25.4kb，其基因组结构与一般冠状病毒(Coronavirus,CoV)相似，基因组结构从5’-3’末端依次为复制酶开放阅读框lab(replicaseORFlab),S糖蛋白基因(spike,S)、小膜蛋白基因(envelope,E)、膜蛋白基因(membrane,M)以及核衣壳蛋白基因(n本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪丁型冠状病毒重组N蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：<1>PDCoV N基因片段的扩增对PDCoV的RNA进行反转录获得cDNA，然后采用特异性引物N‑P1和N‑P2对PDCoV N基因进行PCR扩增，所述特异性引物N‑P1和N‑P2分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列；<2>原核表达质粒pET32a‑N的构建将PCR扩增得到的PDCoV N基因片段连接pMD18‑T克隆载体，转化DH5α感受态细胞获得pMD18‑N克隆质粒；将pMD18‑N克隆质粒和pET‑32a(+)分别进行双酶切，回收N基因和pET‑32a(+)载...

【技术特征摘要】
1.一种猪丁型冠状病毒重组N蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：<1>PDCoVN基因片段的扩增对PDCoV的RNA进行反转录获得cDNA，然后采用特异性引物N-P1和N-P2对PDCoVN基因进行PCR扩增，所述特异性引物N-P1和N-P2分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列；<2>原核表达质粒pET32a-N的构建将PCR扩增得到的PDCoVN基因片段连接pMD18-T克隆载体，转化DH5α感受态细胞获得pMD18-N克隆质粒；将pMD18-N克隆质粒和pET-32a(+)分别进行双酶切，回收N基因和pET-32a(+)载体，利用T4连接酶将pET-32a(+)和N基因连接过夜后转化到DH5α感受态细胞后提取质粒得到原核表达质粒pET32a-N；<3>重组N蛋白的获取将原核表达质粒pET32a-N转化BL21感受态细胞，加入IPTG诱导，菌液超声波裂解，离心，收集上清和沉淀，SDS-PAGE电泳确定重组N蛋白主要在上清中表达，按照康为世纪公司His标签蛋白纯化试剂盒的纯化方法获得重组N蛋白。2.根据权利要求1所述的猪丁型冠状病毒重组N蛋白的制备方法，其特征在于步骤<1>中：PCR扩增的反应体系和反应条件为：反应体系：TaqMix12.5μL，灭菌ddH2O9μL，上下游引物N-P1、N-P2各0.5μL，cDNA2.5μL；反应条件：95℃预变性5min；95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸90s，32个循环；最后72℃延伸5min。3.根据权利要求1所述的猪丁型冠状病毒重组N蛋白的制备方法，其特征在于步骤<2>按以下操作进行：将PCR产物电泳后进行胶回收纯化，得到PDCoVN基因片段，连接pMD18-T克隆载体，转化DH5α感受态细胞，涂板于含有Amp的LB平板上培养过夜，挑取单个菌落接种于含有Amp的LB液体培养基中震荡10-12小时，抽提获得pMD18-N克隆质粒。4.根据权利要求1所述的猪丁型冠状病毒重组N蛋白的制备方法，其特征在于步骤<2&g...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦毅斌，刘磊，卢冰霞，李斌，周英宁，段群棚，何颖，赵武，梁家幸，蒋冬福，卢敬专，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西,45