一种利用酶标仪准确检测植物甾醇酯含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用酶标仪准确检测植物甾醇酯含量的方法，该方法：取待测样品，加入到乙酸乙酯中，超声波处理至完全溶解后，得到植物甾醇酯待测液；将待测液和质量浓度为0.0015～0.015％的磷硫铁显色剂混合摇匀后，室温下显色，得到显色液；取50～300μL的显色液至于酶标仪中进行检测，测得待测样品的吸光光度值；绘制标准曲线，得到待测样品中植物甾醇酯的含量。本发明专利技术方法通过采用乙酸乙酯作为植物甾醇酯的溶剂，采用质量浓度为0.0015～0.015％的磷硫铁溶液作为显色剂，与酶标仪检测进行配合，不仅实现了在微量条件下进行检测，达到通量高检测的目的，而且检测的准确度高、精密度高、检出限低、显色稳定。

【技术实现步骤摘要】
一种利用酶标仪准确检测植物甾醇酯含量的方法
本专利技术涉及植物甾醇酯含量的检测
，尤其涉及一种利用酶标仪准确检测植物甾醇酯含量的方法。
技术介绍
植物甾醇具有降低血浆总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的效果。由于植物甾醇的水溶性和油溶性均不理想，而酯化后能明显提高在食用油和脂肪中的溶解度，甾醇酯能够在人体内转化成甾醇和脂肪酸，植物甾烷醇酯在肠道中的水解率达到90％，所以其具有植物甾醇和脂肪酸两部分的生理功能。植物甾烷醇酯主要有β－谷甾醇酯，植物甾醇酯，菜油甾醇酯三类，目前，植物甾醇酯主要应用于涂抹食品和色拉调料中。植物甾醇酯制品已经获得FDA“一般认为安全(GRAS)”的认可，成为功能性食品的一种发展方向。植物甾醇酯的检测在国内外的研究较少，主要集中于植物甾醇的检测。目前，检测植物甾醇的方法有分光光度法、高效液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法以及红外光谱法等。其中，高效液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法及红外光谱法由于测定成本高、操作复杂，皆不适用于大批量样品的检测，而分光光度法操作简便、成本较低，分光光度法中主要有可见光比色法和酶标仪微量法。紫外—可见光分光光度计在植物甾醇的检测中较为普遍，其样品的前处理方法主要为：以无水乙醇作为溶剂配制一定浓度的植物甾醇溶液，加入一定量的10％磷硫铁显色剂震荡摇匀，在室温中显色一定时间。利用紫外—可见光分光光度计检测植物甾醇含量。但是，该方法在检测过程中存在检测通量低，操作复杂，一般一次只能检测三个左右的样品，对于大批量的样品操作时间长、清洗不方便、显色稳定性差，以及检测的样品量大等问题。针对以上不足，采用多功能酶标仪代替紫外—可见光分光光度计，能高效、准确、快速检测植物甾醇酯含量，更省时省力。然而，对于植物甾醇酯的检测而言，常规紫外—可见光分光光度计检测植物甾醇时所采用的样品前处理方法，并不适用于植物甾醇酯在多功能酶标仪上的检测。因此，有必要探究一种适合于植物甾醇酯在多功能酶标仪上进行检测的方法，从而同时实现高通量检测和精准检测的目的。
技术实现思路
本专利技术提供了一种利用酶标仪准确检测植物甾醇酯含量的方法，该方法不仅可以在微量条件下进行含量检测，达到高通量检测的目的，而且还具有检测准确度高、精密度高、检出限低、显色稳定等特点，尤为适合植物甾醇酯的检测。具体技术方案如下：一种利用酶标仪准确检测植物甾醇酯含量的方法，包括以下步骤：(1)取含植物甾醇酯的待测样品，加入到溶剂乙酸乙酯中，超声波处理至植物甾醇酯完全溶解后，得到植物甾醇酯待测液；(2)将植物甾醇酯待测液和质量浓度为0.0015～0.015％的磷硫铁显色剂混合摇匀后，室温下显色，得到显色液；(3)取50～300μL的显色液至于酶标仪中进行检测，测得待测样品的吸光光度值；(4)取植物甾醇酯标准样品，根据步骤(1)～(3)，得到不同浓度标准样品的吸光光度值，绘制标准曲线后，得到吸光光度值与植物甾醇酯含量的线性回归方程；(5)将步骤(3)中待测样品的吸光光度值代入步骤(4)的线性回归方程中，得到待测样品中植物甾醇酯的含量。本专利技术中所述的含植物甾醇酯的待测样品可以为含植物甾醇酯的功能性蛋白饮料或人造奶油等。其中，由于本专利技术检测方法能够排除单糖、蛋白质以及吐温系列有机溶剂的干扰，所以尤为适合测定蛋白饮品中的植物甾醇酯含量。本专利技术对溶剂类型进行了大量筛选(实施案例中以四种溶剂为例)，发现只有采用乙酸乙酯作为溶剂，获得的植物甾醇酯待测液才能够与特定浓度范围内的磷硫铁显色剂相互配合，获得良好的线性关系，并在酶标仪上达到准确度高、精密度高、检出限低和显色稳定的检测效果。其中，乙酸乙酯同时具备以下三个条件：(1)能快速溶解植物甾醇酯，且溶解度高；(2)能够与显色剂互溶，不出现分层现象；(3)不与显色剂发生显色反应，且显色稳定。上述条件会对酶标仪检测结果的准确性产生巨大影响。此外，本专利技术采用的显色剂尤为适合酶标仪的检测，而显色剂的用量也是决定酶标仪检测准确性的关键因素。在分光光度法测定植物甾醇含量中，磷硫铁显色剂的质量浓度通常都0.15％左右；但本专利技术试验发现，对于酶标仪而言，选择质量浓度为0.0015％～0.015％的FeCl3磷酸溶液作为显色剂，不仅能够保证酶标仪显示的吸光值在0.2～0.7之间，显色良好，该浓度下不会受到溶剂的影响，显色稳定；而且能够保证检测结果的准确性。进一步地，步骤(1)中，所述超声波处理的时间为5～60min，功率为90～110W；更进一步地，所述超声波处理的时间为5min。超声时间过短则溶解不完全，超声时间过长则没有必要。进一步地，步骤(1)中，待测样品中的植物甾醇酯与乙酸乙酯的质量体积比为25～125μg:1mL；在实际检测过程中，可以先初步估计待测样品中植物甾醇酯的大致含量范围，再确定乙酸乙酯的用量；试验发现，在该浓度下检测效果良好，植物甾醇酯的浓度与吸光度值呈线性关系。进一步地，步骤(2)中，所述显色的时间为25min～2h；更进一步地，所述显色的时间为25min；试验发现，显色25min后显色效果好，且两个小时内保持稳定。进一步地，步骤(2)中，所述磷硫铁显色剂的制备方法为：将FeCl3﹒6H2O溶于浓磷酸中，磷酸定容后，得到FeCl3溶液；其中，浓磷酸的体积浓度为80～90％。进一步地，步骤(3)中，所述酶标仪检测时的吸收波长为400～700nm；更进一步地，所述吸收波长为480～500nm；经试验证明，上述显色液在492nm处有较大吸收波长，显色反应吸光度值较大。进一步地，步骤(3)中，所述标准曲线中植物甾醇酯的浓度范围为25～125μg/mL；即本专利技术能够检测的植物甾醇酯的浓度范围是25～125μg/mL，若超出该范围，则标准曲线R2＜0.99，不成线性关系。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术方法通过采用乙酸乙酯作为植物甾醇酯的溶剂，采用质量浓度为0.0015％～0.015％的磷硫铁溶液作为显色剂，与酶标仪检测进行配合，不仅实现了在微量条件下进行检测，达到通量高检测的目的，而且检测的准确度高、精密度高、检出限低、显色稳定。(2)本专利技术方法通过多功能酶标仪检测植物甾醇酯的含量，不仅准确、高效、便捷，而且检测成本低、检测通量高，可以大批量检测。(3)以磷硫铁溶液为显色剂，乙酸乙酯为溶剂，与植物甾醇酯形成棕黄色络合物，溶剂溶解植物甾醇酯效果好、时间短，显色稳定、不分层，实现水相与油相在一定量中的互溶。(4)本专利技术方法还可以排除葡萄糖等单糖、大米蛋白等蛋白质以及Tween20等吐温系列对检测样品的干扰。附图说明图1为实施例1中制得的不同植物甾醇酯在乙酸乙酯中含量与对应吸光度值的标准曲线图。图2为实施例2中制得的不同波长(400～700)下显色反应所对应的吸光度值图。图3为实施例2中制得的不同波长(480～500)下显色反应所对应的吸光度值图。图4为实施例2中制得的不同显色剂添加量与对应吸光度值的标准曲线图。图5为实施例2中制得的不同显色时间与对应吸光度值的标准曲线图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述，以下列举的仅是本专利技术的具体实施例，但本专利技术的保护范围不仅限于此。下列实施例中，磷硫铁显色剂的制备方法如下：取10gFeCl3﹒6H2O(AR级)溶于体积分数本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用酶标仪准确检测植物甾醇酯含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取含植物甾醇酯的待测样品，加入到溶剂乙酸乙酯中，超声波处理至植物甾醇酯完全溶解后，得到植物甾醇酯待测液；(2)将植物甾醇酯待测液和质量浓度为0.0015％～0.015％的磷硫铁显色剂混合摇匀后，室温下显色，得到显色液；(3)取50～300μL的显色液至于酶标仪中进行检测，测得待测样品的吸光光度值；(4)取植物甾醇酯标准样品，根据步骤(1)～(3)，得到不同浓度标准样品的吸光光度值，绘制标准曲线后，得到吸光光度值与植物甾醇酯含量的线性回归方程；(5)将步骤(3)中待测样品的吸光光度值代入步骤(4)的线性回归方程中，得到待测样品中植物甾醇酯的含量。

【技术特征摘要】
1.一种利用酶标仪准确检测植物甾醇酯含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取含植物甾醇酯的待测样品，加入到溶剂乙酸乙酯中，超声波处理至植物甾醇酯完全溶解后，得到植物甾醇酯待测液；(2)将植物甾醇酯待测液和质量浓度为0.0015％～0.015％的磷硫铁显色剂混合摇匀后，室温下显色，得到显色液；(3)取50～300μL的显色液至于酶标仪中进行检测，测得待测样品的吸光光度值；(4)取植物甾醇酯标准样品，根据步骤(1)～(3)，得到不同浓度标准样品的吸光光度值，绘制标准曲线后，得到吸光光度值与植物甾醇酯含量的线性回归方程；(5)将步骤(3)中待测样品的吸光光度值代入步骤(4)的线性回归方程中，得到待测样品中植物甾醇酯的含量。2.如权利要求1所述的利用酶标仪准确检测植物甾醇酯含量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述超声波处理的时间为5～60min，功率为90～110W。3.如权利要求1所述的利用酶标仪准确检测植物甾醇酯含量的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯思敏，孙培龙，王章铁，王丹，邵平，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33