本发明专利技术公开了一种控制半矮秆多分蘖性状的基因Hvhtd，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。本发明专利技术还同时提供了上述半矮秆多分蘖基因Hvhtd编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所述。本发明专利技术还同时提供了基于内含子2的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因Hvhtd的分子标记SNP62；本发明专利技术所获得的分子标记SNP62，可以鉴定大麦中是否含有Hvhtd半矮秆多分蘖基因。本发明专利技术利用该标记进行Hvhtd基因的半矮秆多分蘖育种辅助选择可以保证100％的准确率，加快大麦半矮秆多分蘖育种进度。
【技术实现步骤摘要】
基于内含子2的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因Hvhtd的分子标记及其应用
本专利技术涉及鉴别大麦半矮秆多分蘖基因Hvhtd的基因标记方法及相应引物，所述方法属于农业生物
，可以用于大麦半矮秆多分蘖种质的快速筛选和含Hvhtd突变基因的分子标记辅助育种。
技术介绍
人口增长、气候变化和自然环境破坏等诸多因素导致了全球粮食短缺，如何提高作物的产量成为育种家普遍关注的问题。上个世纪60年代，半矮秆基因的应用显著提高了作物产量，被称之为“绿色革命”(Pengetal.,1999；Monnaetal.,2002)，“绿色革命基因”涉及赤霉素代谢途径。半矮秆作物增加了作物的抗倒性，但同时也增加了肥料的投入量，导致了生产成本的提高和环境污染等问题。因此，迫切需要寻找一种新的遗传变异来提高作物的产量。分蘖和株高是影响作物产量和株型的两个非常重要的农艺性状(SakamotoandMatsuoka,2004；WangandLi,2008；Alqudahetal.,2016)，虽然他们受到光照，温、湿度、营养和种植方式等环境因素的影响，但是在很大程度上还是由遗传因素决定。因此，研究控制分蘖和株高的基因对于提高作物产量具有重要的意义。在大麦中，目前报道了5个半矮秆多分蘖基因，分别是int-c,mnd,gra-a,int-m和fol-a(Drukaetal.,2011；Hussienetal.,2014)。然而，只有int-c和mnd被克隆，int-c是水稻和玉米TB1基因的同源基因，mnd编码细胞色素P450蛋白酶(Ramsayetal.,2011；Mascheretal.,2014)。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克隆到了一个大麦中半矮秆多分蘖基因Hvhtd，提供了一种与半矮秆多分蘖性状关联的分子标记；本专利技术所获得的分子标记SNP62，可以鉴定大麦中是否含有Hvhtd半矮秆多分蘖基因。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种控制半矮秆多分蘖性状的基因Hvhtd：所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所述。本专利技术还同时提供了上述半矮秆多分蘖基因Hvhtd编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO：3所述。本专利技术还同时提供了基于内含子2的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因Hvhtd的分子标记SNP62，以大麦作为物种，所述分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，正向引物为：htdallele-1GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAATATATTGGTTCAGGCTCTCAGAHua30allele-2GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAATATATTGGTTCAGGCTCTCAGG反向引物(共同反向引物)GGCAGCATTCACTGCTTCAA。注：带下划线的为接头引物。本专利技术还提供了利用上述分子标记SNP62鉴定大麦半矮秆多分蘖基因Hvhtd的方法，包括以下步骤：(1)提取待测大麦品种基因组DNA(采用CTAB法(Steinetal.,2001)；(2)利用分子标记SNP62对大麦基因组DNA进行PCR扩增；(3)根据PCR产物荧光信号的差异，使用QuantStudioReal-TimePCR软件分析，进而鉴别出每个待测大麦的基因型(即，鉴定出属于纯合野生型，纯合突变型和杂合型，这3类基因型中的哪种)。作为本专利技术的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因Hvhtd的方法的改进，步骤2)的KASParPCR反应体系为：1μL基因组DNA(浓度为100ng/μL)，0.1μL引物，1.4μL灭菌水和2.5μLKASPBuffer，反应总量为5μL；PCR反应在ABIViiA7荧光定量PCR仪上进行，反应程序为：95℃15min；94℃变性20s，61℃(-0.6℃/循环)退火60s，10个循环；再94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环；所述0.1μL引物中，2种正向引物浓度各为10pmol/L，反向引物(共同反向引物)浓度为30pmol/L。本专利技术使用EMS诱变获得了一个半矮秆多分蘖突变体材料htd，并克隆了控制该半矮秆多分蘖性状的基因Hvhtd，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所述。该半矮秆多分蘖基因Hvhtd编码的蛋白质具有SEQIDNO：3所述的氨基酸序列。相对应的，野生型大麦HORVU2Hr1G098820基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所述，其编码的蛋白质，具有如SEQIDNO：4所述的氨基酸序列。本专利技术使用化学诱变剂EMS处理大麦品种花30，经过多代筛选鉴定获得了一个性状稳定遗传的半矮秆多分蘖突变体htd，通过BSR-Seq和基因定位的方法克隆了半矮秆多分蘖基因Hvhtd，研究发现Hvhtd基因是由于其野生型大麦基因HORVU2Hr1G098820内含子2的第一个碱基由G变为A，使该基因的剪切方式发生改变，从而导致编码的蛋白发生改变，产生半矮秆多分蘖表型，该基因编码一种胰蛋白酶，不同于以前报道的大麦半矮秆多分蘖基因。利用该突变位点本专利技术设计了一个KASPar标记能够快速准确的检测大麦材料中是否含有Hvhtd突变基因。即，本专利技术序列分析发现，野生型大麦HORVU2Hr1G098820基因与半矮秆多分蘖突变体htd的Hvhtd基因在核苷酸序列上存在一个单碱基突变，HORVU2Hr1G098820基因的第2个内含子第一个碱基由G变为A，该突变导致了基因剪切方式发生改变，从而导致编码蛋白提前终止，产生了半矮秆多分蘖的表型。半矮秆多分蘖突变体htd的表型为：叶片细窄，叶色深绿；分蘖数23.3-27.8，是相应的野生型的1.54-1.97倍；株高大约75cm，比相应的野生型矮5.6-11.1cm。图5的左侧为苗期的突变体Htd，右侧为苗期的野生型花30；图6的左侧为抽穗期的突变体Htd，右侧为抽穗期的野生型花30。本专利技术利用生物技术克隆了一个大麦半矮秆多分蘖基因Hvhtd，它不同于以前报道大麦半矮秆多分蘖基因，利用其单碱基突变位点我们设计了一个KASPar标记SNP62，该标记具有以下优点：1)、本专利技术所获得的基因标记是根据基因内部碱基突变设计的，因此不存在遗传交换，也不需要表型的进一步验证。2)、本专利技术设计的KASPar标记直接利用采集的荧光信号进行基因分型，无需电泳、染胶、读带等过程，可以简单快速，高通量的鉴别大麦种质资源中是否含有Hvhtd基因。3)、利用本专利技术方法进行分子标记辅助选择育种，显著提高大麦品种的选择效率。4)、利用该标记进行Hvhtd基因的半矮秆多分蘖育种辅助选择可以保证100％的准确率，加快大麦半矮秆多分蘖育种进度。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1为Hvhtd基因结构及其与野生型的差异位点；图2突变体htd和其野生型花30中基因Hvhtd的氨基酸序列对比；具体是突变体htd半矮秆多分蘖基因Hvhtd和其野生型花30中相对应基因HORVU2Hr1G098820的氨基酸序列比对。图3为利用本专利技术设计的KASPar标记SNP62鉴定突变体htd及其野生型花30的Hvhtd基因型。左上角为野生型花30(在彩色图中显示为蓝色)，右下角的为突变体htd(在彩色图中显示为红色)，■为阴性对照，均为2个重复。图4为利用本专利技术设计的KASP本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.控制半矮秆多分蘖性状的基因Hvhtd，其特征是：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。
【技术特征摘要】
1.控制半矮秆多分蘖性状的基因Hvhtd，其特征是：所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所述。2.如权利要求1所述的半矮秆多分蘖基因Hvhtd编码的蛋白质，其特征是：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO：3所述。3.基于内含子2的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因Hvhtd的分子标记SNP62，以大麦作为物种，其特征是：所述分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，正向引物为：htdallele-1GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAATATATTGGTTCAGGCTCTCAGAHua30allele-2GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAATATATTGGTTCAGGCTCTCAGG反向引物GGCAGCATTCACTGCTTCAA。4.利用如权利要求3所述的分子标记SNP62鉴定大麦半矮秆多分蘖基因Hvhtd的方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：华为，汪军妹，朱靖环，尚毅，巫小建，杨建明，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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