酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙制造技术

本发明专利技术属于酶法合成的技术领域，涉及一种酶法制备L‑5‑甲基四氢叶酸钙的方法，所述方法包括如下步骤：(1)以叶酸为原料，使用锌粉将叶酸还原为二氢叶酸；(2)二氢叶酸中加入二氢叶酸还原酶、葡萄糖脱氢酶，反应得到L‑四氢叶酸；(3)L‑四氢叶酸中加入甲醛和硼氢化物反应得到L‑5‑甲基四氢叶酸；(4)L‑5‑甲基四氢叶酸成盐得到L‑5‑甲基四氢叶酸钙。本发明专利技术提供了一条行之有效的使用酶法制备L‑5‑甲基四氢叶酸钙的方法，这种制备方法不用拆分，反应温和，收率高，产品纯度高，环境友好，具有很好的产业化前景。

【技术实现步骤摘要】
酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙
本专利技术属于酶法合成的
，涉及一种酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙的方法。
技术介绍
L-5-甲基四氢叶酸钙，又称(6S)-5-甲基四氢叶酸钙。(6S)-5-甲基四氢叶酸是组织和血叶酸的主要形式，它在人体中不需要经过繁琐的酶促步骤，可以直接参与人体内多种重要的生化反应(如嘌呤和胸腺嘧啶的合成等)。L-5-甲基四氢叶酸可用做药和食品添加剂，用作维生素制剂，预防神经管缺陷，治疗抑郁症，治疗巨幼红细胞贫血等，研究表明，L-5-甲基四氢叶酸是叶酸类药物中唯一可以渗透过血脑屏障的药物，具有防治阿尔茨海默病(老年痴呆症)的作用，因此它具有其他叶酸类药物无法比拟的优越性，具有巨大的市场前景。由于L-5-甲基四氢叶酸非常不稳定，极易氧化，因此合成高纯度、高稳定性的四氢叶酸具有成本昂贵、收率低等缺点，而四氢叶酸盐具有优异的稳定性，大量实验证明，在特定的碱溶液中可以分离纯化出高纯度、高稳定性的四氢叶酸盐，特别是其钙盐L-5-甲基四氢叶酸钙。现有技术中的L-5-甲基四氢叶酸钙合成方法，均是使用化学合成，化学合成的5-甲基四氢叶酸主要是通过叶酸经氢化和甲基化获得，通常在5,6位双键加氢时，在6位形成光学活性碳原子，以(6R)-或(6S)-5-甲基四氢叶酸的形式存在。(6S)-5-甲基四氢叶酸现有的工艺路线是以叶酸为原料,经还原、甲基化、拆分等步骤合成而得。化学合成L-5-甲基四氢叶酸钙的方法都存在拆分难，收率低，污染大，产业化困难等诸多问题，因此寻找一条化学合成之外的方法就成为非常有现实意义的探索。以酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙相关的现有技术中，文献《MethodsinEnzymology》,1971,18(6):728-731ANewPreparationofTetrahydrofolicAcid中介绍了二氢叶酸还原酶催化叶酸生成二氢叶酸，再用NADPH、粪链球菌的透析提取物、胶联葡萄糖-G25得到消旋的四氢叶酸，但使用此法并不能得到L-四氢叶酸。
技术实现思路
本专利技术提供了一条行之有效的使用酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙的方法。具体而言，本专利技术的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，包括如下步骤：(1)以叶酸为原料，使用锌粉将叶酸还原为二氢叶酸；(2)二氢叶酸中加入二氢叶酸还原酶、葡萄糖脱氢酶，反应得到L-四氢叶酸；(3)L-四氢叶酸中加入甲醛和硼氢化物反应得到L-5-甲基四氢叶酸；(4)L-5-甲基四氢叶酸成盐得到L-5-甲基四氢叶酸钙。上述步骤(1)中锌粉还原叶酸的反应是在碱性环境下进行的，所述锌粉与叶酸的质量比为1:2-1:4，反应时间为1-3小时，反应温度为10-50℃。所述碱性环境使用NaOH溶液滴加到叶酸水溶液中而成，反应完毕后使用磷酸再次调节pH值7.0-7.5，过滤后得到二氢叶酸溶液。上述二氢叶酸还原酶为二氢叶酸还原酶湿菌体、葡萄糖脱氢酶为葡萄糖脱氢酶发酵湿菌体。上述步骤(2)的反应中加入葡萄糖，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下简称NADP)，乙二胺四乙酸EDTA二钠(以下简称EDTA二钠)。NADP作为辅酶，EDTA二钠作为吸附剂及稳定剂。上述二氢叶酸还原酶湿菌体、葡萄糖脱氢酶发酵湿菌体与叶酸的质量比为2:1:10-3:2:10，优选为2:1:10。上述葡萄糖、NADP和EDTA的加入量分别为叶酸质量的45％-50％、0.2％-0.5％、10％-20％。上述步骤(2)的反应时间为1-3小时，反应温度为10-50℃，优选为35℃反应3小时。上述步骤(2)反应结束后使用盐酸调节pH值至3.3-3.5，过滤后得到L-四氢叶酸湿粉。上述步骤(3)在碱性环境下滴加甲醛，之后在0-10℃下滴加硼氢化物，升温至35-75℃保温反应，反应时间为0.5-2小时。上述碱性环境为L-四氢叶酸湿粉加入水后，NaOH调节pH值至7.5-10。上述滴加的硼氢化物为加入少量NaOH的硼氢化物溶液。反应后冷却至0-10℃，调节pH值至6.0-8.0，0-10℃保温搅拌1-10小时，过滤得到L-5-甲基四氢叶酸溶液。上述甲醛的加入量为叶酸的当量比为1:1-1.3:1，所述硼氢化物为硼氢化钾或硼氢化钠，其加入量与叶酸的当量比为3:1-4:1。步骤(4)的成盐反应使用现有技术中的方法，通过向L-5-甲基四氢叶酸溶液中滴加氯化钙溶液成盐。上述反应的方程式如下。本专利技术提供了一种不同于传统化学合成L-5-甲基四氢叶酸的方法，通过酶法制备(6S)-5-甲基四氢叶酸钙，这种制备方法不用拆分，反应温和，收率高，产品纯度高，环境友好，具有很好的产业化前景。具体实施方式下面通过具体实施方式的描述对本专利技术作进一步说明，但这并非是对本专利技术的限制，本领域技术人员根据本专利技术的基本思想，可以做出各种修改或者改进，但是只要不脱离本专利技术的基本思想，均在本专利技术的范围之内。本专利技术实施例中所用的各种原料和试剂如无特别说明均为市售购买。本专利技术实施例中的检测方法采用USP40中规定的CalciumL-5-Methyltetrahydrofolate检测方法和标准。本专利技术所使用的HPLC检测仪器是AgilentTechnologies1260infinity。柱子型号为HYPERSIL-ODS250x4mm，5μm。实施例1：二氢叶酸还原酶湿菌体的制备。取高表达二氢叶酸还原酶的大肠杆菌基因工程菌，接种至LB平板进行预培养(LB培养基：每升5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g氯化钠，20g琼脂粉)，再接种至TB摇瓶中继续培养(TB培养基：每升24g酵母提取物，12g蛋白胨，2g磷酸二氢钾，16g三水磷酸氢二钾，5g甘油)，培养完成后离心收集菌体，倒掉上清液，菌体沉淀收集到自封袋中，-20℃冰箱冷冻备用。实施例2：葡萄糖脱氢酶湿菌体的制备。取高表达葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌基因工程菌，接种至LB平板进行预培养(LB培养基：每升5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g氯化钠，20g琼脂粉)，再接种至TB摇瓶中继续培养(TB培养基：每升24g酵母提取物，12g蛋白胨，2g磷酸二氢钾，16g三水磷酸氢二钾，5g甘油)，培养完成后离心收集菌体，倒掉上清液，菌体沉淀收集到自封袋中，-20℃冰箱冷冻备用。实施例3(1)在2000ml反应瓶中加入100g叶酸、1000ml水，搅拌下滴加预先配制的NaOH溶液(60gNaOH+165ml水)。滴加完毕后加50g锌粉，10℃反应1小时，加磷酸调反应液pH至7.0，过滤，得二氢叶酸溶液；(2)滤液加入10g葡萄糖脱氢酶发酵湿菌体和20g二氢叶酸还原酶湿菌体，45g葡萄糖，0.2gNADP，10gEDTA二钠，10℃反应1小时，反应结束后过滤，用盐酸调pH至3.3，过滤，得L-四氢叶酸湿粉。(3)在5000ml反应瓶中加入上述L-四氢叶酸湿粉，加600ml水，用NaOH调pH至7.5，滴加6.3ml甲醛(1.0eq，以叶酸计)。降低温度至10℃，滴加硼氢化钠溶液(25.7g(3eq，以叶酸计)加100ml水+0.35gNaOH)，滴加完毕后，缓慢升温至35℃。保温反应0.5小时，冷却至5℃以下，用盐酸调pH至8.0，保温10℃搅拌10小时，过滤，得L-5-甲基四氢叶酸溶液。(4)L-5-甲基四氢叶酸溶液中加入氯化钙溶液(37.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.酶法制备L‑5‑甲基四氢叶酸钙，包括如下步骤：(1)以叶酸为原料，使用锌粉将叶酸还原为二氢叶酸；(2)二氢叶酸中加入二氢叶酸还原酶、葡萄糖脱氢酶，反应得到L‑四氢叶酸；(3)L‑四氢叶酸中加入甲醛和硼氢化物反应得到L‑5‑甲基四氢叶酸；(4)L‑5‑甲基四氢叶酸成盐得到L‑5‑甲基四氢叶酸钙。

【技术特征摘要】
1.酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，包括如下步骤：(1)以叶酸为原料，使用锌粉将叶酸还原为二氢叶酸；(2)二氢叶酸中加入二氢叶酸还原酶、葡萄糖脱氢酶，反应得到L-四氢叶酸；(3)L-四氢叶酸中加入甲醛和硼氢化物反应得到L-5-甲基四氢叶酸；(4)L-5-甲基四氢叶酸成盐得到L-5-甲基四氢叶酸钙。2.根据权利要求1所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，所述步骤(1)中锌粉还原叶酸的反应是在碱性环境下进行的，所述锌粉与叶酸的质量比为1：2-1：4，反应时间为1-3小时，反应温度为10-50℃。3.根据权利要求1所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶为二氢叶酸还原酶湿菌体、葡萄糖脱氢酶为葡萄糖脱氢酶发酵湿菌体。4.根据权利要求3所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，所述步骤(2)的反应中加入葡萄糖、NADP和EDTA。5.根据权利要求3所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶湿菌体、葡萄糖脱氢酶发酵湿菌体...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞正查，张仲景，陈天松，梁超，刘露，王程鹏，
申请(专利权)人：浙江圣达生物药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33