化学发光底物制造技术

本发明专利技术提供了表现出快速的温育期和改善的稳定性的碱性磷酸酶化学发光底物制剂以用于免疫测定法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】化学发光底物本申请作为PCT国际申请提交于2017年6月30日，并且要求提交于2016年6月30日的美国临时专利申请序列号62/357,091的优先权，该专利申请的整个公开内容全文以引入方式并入。
技术介绍

本专利技术提供了表现出快速的温育期和改善的稳定性的碱性磷酸酶化学发光底物制剂以用于免疫测定法。相关技术描述碱性磷酸酶是可在酶联免疫测定法中作为标志物或标记使用的水解酶。这些酶的化学发光检测提供了安全、便利和灵敏的手段，以提供样品中酶的量或酶标记的分析物的量的定量测量。碱性磷酸酶化学发光底物用作免疫测定法中的检测体系。在一些形式中，分析物可用磷酸酶标记，或者可通过磷酸酶标记的特异性“结合配偶体”特异性地检测。磷酸酶可作为标记直接引入分析物结合化合物上。另选地，分析物结合化合物可结合于分析物结合化合物的至少一种磷酸酶标记的特异性结合物质。另选地，分析物结合化合物可用至少一种第二特异性结合物质标记，其随后结合于第二特异性结合物质的磷酸酶标记的结合配偶体。根据包括性能和稳定性的多种因素，一些底物在自动免疫测定系统上更有用。与碱性磷酸酶接触时产生化学发光的化合物(或分析物)公开于美国专利6,045,727；6,090,571；6,139,782；6,218,137；6,270,695；和6,296,787，这些专利中的每一个以引用方式并入本文。LUMI-PHOS(Lumigen，Southfield，Michigan)是包括DxI和Access系统(BeckmanCoulter，BreaCA)的自动免疫测定系统中所用的商业碱性磷酸酶化学发光底物制剂。LUMI-PHOS具有期望的灵敏性、开瓶稳定性、背景化学发光和校准曲线漂移，但是在那些自动系统上产生信号需要5-6分钟的温育时间。在那些自动系统上较快的周转时间(TAT)是期望的。LumigenAPS-5(Lumigen，Southfield，Michigan)是另一种商业碱性磷酸酶底物制剂。LumigenAPS-5是用于ELISA检测碱性磷酸酶(AP)缀合物分子的基于二氢吖啶的化学发光底物组合物。相比于LUMI-PHOSLumigenAPS-5提供较少的温敏性光输出和较快速的峰强度。光发射在450nm处为最大值。LumigenAPS-5表现出快速的温育期和良好的灵敏性，但因受到一定程度限制的开瓶稳定性、背景化学发光和校准曲线漂移而不适合用于自动免疫测定系统。因此，相比于LUMI-PHOSAPS-5在储存期间遭受信号强度损失和提高的热敏性。如图1所示，APS-5在4℃下储存时12个月内表现出约35％的信号损失。期望具有这样一种碱性磷酸酶底物：具有由APS-5表现出的迅速周转时间，与此同时表现出LUMI-PHOS的较长货架期和改善的稳定性，以改善自动免疫测定系统的性能和效率。
技术实现思路
提供了碱性磷酸酶化学发光底物制剂(“底物制剂”)以用于免疫测定系统，特别是自动免疫测定系统。这些水性底物制剂在磷酸酶的存在下产生化学发光。在一些实施方案中，提供了表现出快速的信号产生的改善的底物制剂。相比于当前的商业底物制剂，本专利技术的底物制剂提供改善的信号产生时间(或周转时间)、改善的稳定性(例如降低的热敏性)、增强的碱性磷酸酶特异性和/或增强的测定灵敏度中的一者或多者。在一些实施方案中，底物制剂包含：a)式I的化学发光化合物或其盐：其中A为C1-6卤代烷基、萘基、苯基、取代的苯基或杂芳基，其中取代的苯基包含1至3个卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C(O)R15、CN或NO2取代基；R1选自C5-14芳基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基和C5-14芳烷基基团；R7-R14独立地为H、C1-6烷氧基、卤素或C1-6烷基，或者R7-R8、或R8-R9、或R9-R10R11-R12、或R12-R13、或R13-R14可一起连接为包含至少一个5或6元环的碳环或杂环环系；R15为C1-6烷基；每个M独立地选自H、或碱金属、碱土金属、过渡金属、铵、鏻鎓、由有机胺形成的盐或氨基酸；Z为0或S；并且n为0、1或2；b)阳离子芳族化合物，该阳离子芳族化合物的量使化学发光相比于不存在阳离子芳族化合物时产生的化学发光有效地提高；c)背景降低剂；以及d)醚连接的非离子表面活性剂或亲水性聚合物。在一些实施方案中，底物制剂包含(a)0.01mM至50mM化合物I，(b)0.01uM至200uM阳离子芳族化合物，(c)1uM至10mM背景降低剂，以及(d)0.05g/L至20g/L醚连接的非离子表面活性剂或亲水性聚合物。在一些实施方案中，底物制剂包含化合物I，其中Z为S；Ar为苯基或取代的苯基，其中取代的苯基包含1至3个卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基和C1-6卤代烷基取代基；R1为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基；R7-R14独立地为H、C1-6烷氧基、卤素；每个M为Na或H；并且n为0、1或2。在具体的实施方案中，底物制剂包含选自以下的化合物I以及在一些实施方案中，底物制剂包含阳离子芳族化合物(CAC)II：其中Q选自卤素、氰基、--COOR’、--COSR’、--CONR1R2、--CON(R)SO2R”、萘基、蒽基、N-C1-4烷基吖啶基、卤素取代的N-C1-4烷基吖啶基；R为C1-4烷基；R’、R”独立地选自C1-6烷基、芳基、烷基取代的芳基；R1、R2独立地选自H、C1-6烷基、芳基和烷基芳基；Z为卤离子或硝酸根；并且Y选自H、卤素、C1-4烷基。在一些实施方案中，底物制剂包含阳离子芳族化合物II，其中Q为N-甲基吖啶基、卤素取代的N-甲基吖啶基、萘基或蒽基；R为C1-4烷基；Z-选自Cl-、Br、I-、NO3-，并且Y为H或卤素。在具体的实施方案中，底物制剂包含选自以下的阳离子芳族化合物IIN，N’-二甲基-9，9’-二吖啶二硝酸盐(光泽精)、以及在一些实施方案中，底物制剂包含阳离子芳族化合物II，即N，N’-二甲基二吖啶二硝酸盐(光泽精)。在一些实施方案中，底物制剂包含背景降低剂，该背景降低剂选自亚硫酸锂、亚硫酸钠、亚硫酸钾、亚硫酸氢锂、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、焦亚硫酸锂、焦亚硫酸钠、焦亚硫酸钾、二丁基羟基甲苯(BHT；2，6-双(1，10二甲基乙基)-4-甲基苯酚)、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、3-叔丁基-4-羟基苯甲醚、3-叔丁基-4-羟基苯甲醚和式Ar-B(OH)2的芳族硼酸，其中Ar为苯基、取代的苯基、可或不可包含一个或多个杂原子的稠合芳族环系、可或不可包含一个或多个杂原子的取代的稠合芳族环系，其中取代的芳基基团可具有1至3个独立地选自C1-6烷基、卤素、烷氧基羰基或羟基基团的取代基。在具体的实施方案中，背景降低剂选自苯基硼酸、4-甲苯基硼酸、4-氯硼酸、4-碘硼酸和3-甲氧基羰基苯基硼酸和亚硫酸钠。在一些实施方案中，底物制剂包含根据式(III)的醚连接的非离子表面活性剂：其中R选自C6-22烷基、环烷基、C6-22烷基取代的环烷基、以及单-或二-C6-22烷基-取代的苯基；n为2至200的数；X选自O或S；并且Y选自H或C1-4烷基。在一些实施方案中，底物制剂包含根据式(III)的醚连接的非离子表面活性剂，其中R为C8-20烷基、C8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种底物制剂，所述底物制剂在磷酸酶的存在下产生化学发光，所述底物制剂在水溶液中包含：a)0.01mM至50mM的式I的化学发光化合物或其盐：

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.30 US 62/357,0911.一种底物制剂，所述底物制剂在磷酸酶的存在下产生化学发光，所述底物制剂在水溶液中包含：a)0.01mM至50mM的式I的化学发光化合物或其盐：其中A为C1-6卤代烷基、萘基、苯基、取代的苯基或杂芳基，其中取代的苯基包含1至3个卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C(O)R15、CN或NO2取代基；R1选自C5-14芳基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基和C5-14芳烷基基团；R7-R14独立地为H、C1-6烷氧基、卤素、C1-4烷基，或者R7-R8、或R8-R9、或R9-R10R11-R12、或R12-R13、或R13-R14可一起连接为包含至少一个5或6元环的碳环或杂环环系；R15为C1-6烷基；每个M独立地选自H、或碱金属、碱土金属、过渡金属、铵、鏻鎓、有机胺盐、氨基酸盐或者；Z为O或S；并且n为0、1或2；b)0.01uM至200uM的阳离子芳族化合物(CAC)；c)1uM至10mM的背景降低剂；以及d)0.05g/L至20g/L的醚连接的非离子表面活性剂或亲水性聚合物。2.根据权利要求1所述的底物制剂，其中Z为S；A为苯基或取代的苯基，其中取代的苯基包含1至3个卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基和C1-6卤代烷基取代基；R1为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基；R7-R14独立地为H、C1-6烷氧基、卤素；每个M独立地为H、Na、K或Li；并且n为0、1或2。3.根据权利要求1所述的底物制剂，其中所述式I的化合物选自4.根据权利要求1所述的底物制剂，其中所述阳离子芳族化合物(CAC)选自根据式II的化合物：其中Q选自卤素、氰基、--COOR’、--COSR’、--CONR1R2、--CON(R)SO2R”、萘基、蒽基、N-C1-4烷基吖啶基、卤素取代的N-C1-4烷基吖啶基；R为C1-4烷基；R’、R”独立地选自C1-6烷基、芳基、烷基取代的芳基；R1、R2独立地选自H、C1-6烷基、芳基和烷基芳基；并且Z为卤离子或硝酸根；并且Y选自H、卤素、C1-4烷基。5.根据权利要求4所述的底物制剂，其中Q为N-甲基吖啶基、卤素取代的N-甲基吖啶基、萘基或蒽基；R为C1-4烷基；Z-选自Cl-、Br-、I-、NO3-，并且Y为H或卤素。6.根据权利要求5所述的底物制剂，其中所述CAC选自7.根据权利要求1所述的底物制剂，其中所述背景降低剂选自亚硫酸锂、亚硫酸钠、亚硫酸钾、亚硫酸氢锂、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、焦亚硫酸锂、焦亚硫酸钠、焦亚硫酸钾、二丁基羟基甲苯(BHT；2，6-双(1，10二甲基乙基)-4-甲基苯酚)、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、3-叔丁基-4-羟基苯甲醚、3-叔丁基-4-羟基苯甲醚和式Ar-B(OH)2的芳族硼酸，其中Ar为苯基、取代的苯基、可或不可包含一个或多个杂原子的稠合芳族环系、可或不可包含一个或多个杂原子的取代的稠合芳族环系，其中所述取代的芳基基团可具有1至3个独立地选自C1-6烷基、卤素、烷氧基羰基或羟基基团的取代基。8.根据权利要求7所述的底物制剂，其中所述背景降低剂选自苯基硼酸、4-甲苯基硼酸、4-氯硼酸、4-碘硼酸和3-甲氧基羰基苯基硼酸和亚硫酸钠。9.根据权利要求1所述的底物制剂，其中所述醚连接的非离子表面活性剂具有式(III)：其中R选自C6-22烷基、环烷基、C6-22烷基-取代的环烷基、以及单-或二-C6-22烷基-取代的苯基；n为2至200的数；X选自O或S；并且Y选自H或C1-4烷基。10.根据权利要求9所述的底物制剂，其中所述醚连接的非离子表面活性剂选自聚氧乙烯二醇烷基醚(BRIJ)、聚氧乙烯二醇辛基苯酚醚(TRITON)或聚氧乙烯壬基苯基醚(IGEPAL)。11.根据权利要求1所述的底物制剂，其中所述亲水性聚合...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷努卡·德席尔瓦，罗伯特·A·艾克霍尔特，贾亚·S·科蒂，马克·D·桑迪森，大卫·L·舒姆，谢文华，
申请(专利权)人：拜克门寇尔特公司，
类型：发明
国别省市：美国,US