基于双重检测机理构建的双响应比率荧光探针及其构建方法技术

本发明专利技术提供一种基于双重检测机理构建的双响应比率荧光探针，首先构建基于银刻蚀的比率荧光探针，然后在基于银刻蚀的比率荧光探针中加入H2O2，得到基于双重检测机理构建的双响应比率荧光探针。本发明专利技术首次将内滤效应和电子转移两种响应模式有效组合，采用双响应模式，构建高检测灵敏度的比率荧光探针，能够定量检测H2O2浓度和葡萄糖浓度。

【技术实现步骤摘要】
基于双重检测机理构建的双响应比率荧光探针及其构建方法
本专利技术涉及基于双重检测机理构建的双响应比率荧光探针及其构建方法。
技术介绍
比率荧光探针相对于单一响应的荧光探针，具有灵敏度高，背景小，可实现可视化检测等优势。比率荧光探针根据荧光团的响应模式可以分为参比型(两个荧光团，只有一个荧光团的荧光强度随着被检测物的加入而改变，另外一个荧光团的荧光强度始终保持不变，称为参比)和双响应型(两个荧光团的荧光强度均随着被测物的加入而产生变化。并且变化方向相反，一个增大的同时另外一个减小)。相对于参比型，双响应型的比率荧光探针具有更高的灵敏度，在比色检测时其颜色变化范围更宽。但双响应型比率探针的构建要比参比型复杂，大多数是依靠两个荧光团的共振能量转移实现的，设计共振能量转移的比率探针通常要经过复杂的有机化学合成的过程，过程复杂。贵金属纳米颗粒，如银颗粒，金颗粒等，由于其较宽的、可调的吸收光谱，常用来与荧光纳米颗粒一起构建基于内滤效应的荧光传感。当外加检测物的加入改变了贵金属颗粒的吸收光谱(改变其强度或吸收波长)，内滤效应减弱或被破坏，从而使荧光颗粒荧光恢复。H2O2可以刻蚀黄色的银颗粒为无色的银离子，使其在400nm处的吸收峰不断减弱。基于H2O2对银颗粒的刻蚀，可以进行比色检测；同时基于银颗粒对荧光纳米颗粒的内滤效应，可以发展荧光检测技术。文献中已有较多的相关报道。但均为单一荧光团的荧光探针，比率探针构建较少，双响应型的比率探针构建则更少。
技术实现思路
为提高检测灵敏度，实现可视化检测，本专利技术提供了一种基于双重检测机理构建的双响应比率荧光探针，及其构建方法和检测H2O2浓度以及葡萄糖浓度的方法。两种响应机理分别为内滤效应和电子转移。本专利技术首创性的将内滤效应和电子转移两种检测模式联系在一个检测体系中，提高了检测灵敏度，开创了一种双响应比率荧光探针的构建思路和模式。本专利技术的第一个目的是提供一种基于银刻蚀的比率荧光探针的构建方法，步骤如下：(1)以亮氨酸和尿素为碳源采用微波法制备发射波长在400nm的发蓝光的碳点；(2)通过反相微乳液法将步骤(1)制备的碳点包覆在二氧化硅内部，同时利用3-氨丙基三乙氧基硅烷将其表面修饰上氨基，得到氨基修饰的包覆有碳点的二氧化硅纳米粒子；(3)水热法制备巯基丙酸修饰的发射波长为600nm的CdTe量子点，其表面带有羧基；(4)在EDC/NHS的作用下，利用羧基和氨基的缩合反应，将步骤(3)制备的CdTe量子点修饰到步骤(2)制备的二氧化硅纳米粒子表面，形成比率荧光探针，将比率荧光探针分散于超纯水，得到比率荧光探针溶液；(5)通过NaBH4还原Ag+的方法得到银纳米颗粒，最大吸收波长为400nm；将步骤(4)得到的比率荧光探针溶液与银纳米颗粒直接混合，得到基于银刻蚀的比率荧光探针。上述步骤(1)-(4)采用现有技术中已有的方法制备即可。比如步骤(1)中，将0.3重量份的亮氨酸和1重量份的尿素溶解于水中，微波4min得到淡黄色固体，加入10体积份的水溶解，然后离心得到淡黄色上清液，即为所制备碳点；当重量份表示“g”时，体积份表示“mL”。步骤(2)中，将1.8体积份的曲拉通-100和1.8体积份的正己醇分散在7.5体积份的环己烷中，然后加入0.5体积份的步骤1制备的碳点和0.06体积份的的氨水(28％)以形成微乳液，然后加入0.1体积份的正硅酸乙酯以引发水解，在室温下搅拌混合物10小时后，加入0.02体积份的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)继续反应5小时，使氨基修饰二氧化硅表面，然后用丙酮破乳，所得沉淀洗涤，得到氨基修饰的包覆有碳点的二氧化硅纳米粒子。步骤(3)中，将92.4重量份的Cd(NO3)2·4H2O溶解于75体积份的蒸馏水中，加入0.63体积份的巯基乙酸，并迅速用1.0MNaOH将混合物调节至pH9-10，在N2下搅拌后，迅速加入1体积份的新鲜制备的NaHTe水溶液(使用40毫克NaBH4和38.3毫克碲粉末分散于2mL水中，40℃下反应4个小时得到淡紫色溶液，取用其中的1mL)，将溶液加热至沸腾并回流6小时，得到CdTe量子点溶液，CdTe量子点的表面带有羧基；当重量份表示“mg”时，体积份表示“mL”。步骤(4)中，搅拌下将2体积份的步骤3制备的CdTe量子点溶液与4体积份的H2O和2体积份的EDC/NHS(2mg/mL)混合；15分钟后，将1.3重量份的步骤2制备的二氧化硅纳米粒子注入混合物中，并将混合物在黑暗中剧烈搅拌4小时。通过离心收集得到的沉淀物，即为所制备的比率荧光探针；当重量份表示“mg”时，体积份表示“mL”。作为优选，步骤(5)中，混合后，所述比率荧光探针的浓度为100mg/L，银纳米颗粒的浓度为10μM。本专利技术的第二个目的是提供一种基于银刻蚀的比率荧光探针，其是应用权利要求1或2所述的方法构建的。本专利技术的第三个目的是提供基于双重检测机理构建双响应比率荧光探针的方法，步骤如下：(1)按照权利要求1或2中的方法构建基于银刻蚀的比率荧光探针；(2)在步骤(1)的基于银刻蚀的比率荧光探针中加入H2O2，得到基于双重检测机理构建的双响应比率荧光探针。本专利技术的第四个目的是提供一种基于双重检测机理构建的双响应比率荧光探针，是应用权利要求4的方法构建的。本专利技术的第五个目的是提供上述双响应比率荧光探针在定量检测H2O2浓度，以及定量检测可以产生H2O2的生化反应的原料的浓度中的应用，比如检测葡萄糖浓度。本专利技术的第六个目的是提供一种定量检测H2O2浓度的方法，步骤如下：(1)按照权利要求1或2中的方法构建基于银刻蚀的比率荧光探针；(2)在步骤(1)的基于银刻蚀的比率荧光探针中分别加入系列已知浓度的H2O2，构建系列双响应比率荧光探针，得到系列不同强度的响应信号，测定I400和I600两个波长下的荧光强度；(3)利用两个波长下的荧光强度比值I400/I600与H2O2间的线性关系，构建线性方程；(4)将待检H2O2加入步骤(1)的基于银刻蚀的比率荧光探针中，测定两个波长下的荧光强度比值I400/I600，代入线性方程，得到待检H2O2的浓度。作为优选，步骤(3)中，线性方程的线型范围为1-150μM，检测限为0.28μM。本专利技术的第七个目的是提供一种定量检测葡萄糖浓度的方法，步骤如下：(1)将不同已知浓度的葡萄糖与葡萄糖氧化酶反应，以产生不同浓度的H2O2，然后在此反应溶液中加入银纳米颗粒和权利要求1中所述的比率荧光探针溶液，进行荧光检测，测定I400和I600两个波长下的荧光强度，利用两个波长下的荧光强度比值I400/I600与葡萄糖间的线性关系，得到线性方程；(2)将待检葡萄糖按照步骤(1)中所述方法测定荧光强度比值I400/I600，代入线性方程，得到待检葡萄糖的浓度。作为优选，步骤(1)中，所述银纳米颗粒的浓度为10μM，所述比率荧光探针溶液的浓度为100mg/L。本专利技术的创新点在于：首次将内滤效应和电子转移两种响应模式有效组合，采用双响应模式，构建高检测灵敏度的比率荧光探针，能够定量检测H2O2浓度和葡萄糖浓度，以及其他可以产生H2O2的生化反应的原料的浓度，如利用葡萄糖的氧化为H2O2检测葡萄糖，基于胆固醇氧化酶催化的胆固醇氧化检测胆固醇等。传统的核壳结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于银刻蚀的比率荧光探针的构建方法，其特征在于：步骤如下：(1)以亮氨酸和尿素为碳源采用微波法制备发射波长在400nm的发蓝光的碳点；(2)通过反相微乳液法将步骤(1)制备的碳点包覆在二氧化硅内部，同时利用3‑氨丙基三乙氧基硅烷将其表面修饰上氨基，得到氨基修饰的包覆有碳点的二氧化硅纳米粒子；(3)水热法制备巯基丙酸修饰的发射波长为600nm的CdTe量子点，其表面带有羧基；(4)在EDC/NHS的作用下，利用羧基和氨基的缩合反应，将步骤(3)制备的CdTe量子点修饰到步骤(2)制备的二氧化硅纳米粒子表面，形成比率荧光探针，将比率荧光探针分散于超纯水，得到比率荧光探针溶液；(5)通过NaBH4还原Ag+的方法得到银纳米颗粒，最大吸收波长为400nm；将步骤(4)得到的比率荧光探针溶液与银纳米颗粒直接混合，得到基于银刻蚀的比率荧光探针。

【技术特征摘要】
1.一种基于银刻蚀的比率荧光探针的构建方法，其特征在于：步骤如下：(1)以亮氨酸和尿素为碳源采用微波法制备发射波长在400nm的发蓝光的碳点；(2)通过反相微乳液法将步骤(1)制备的碳点包覆在二氧化硅内部，同时利用3-氨丙基三乙氧基硅烷将其表面修饰上氨基，得到氨基修饰的包覆有碳点的二氧化硅纳米粒子；(3)水热法制备巯基丙酸修饰的发射波长为600nm的CdTe量子点，其表面带有羧基；(4)在EDC/NHS的作用下，利用羧基和氨基的缩合反应，将步骤(3)制备的CdTe量子点修饰到步骤(2)制备的二氧化硅纳米粒子表面，形成比率荧光探针，将比率荧光探针分散于超纯水，得到比率荧光探针溶液；(5)通过NaBH4还原Ag+的方法得到银纳米颗粒，最大吸收波长为400nm；将步骤(4)得到的比率荧光探针溶液与银纳米颗粒直接混合，得到基于银刻蚀的比率荧光探针。2.根据权利要求1所述的基于银刻蚀的比率荧光探针的构建方法，其特征在于：步骤(5)中，混合后，所述比率荧光探针的浓度为100mg/L，银纳米颗粒的浓度为10μM。3.一种基于银刻蚀的比率荧光探针，其特征在于：其是应用权利要求1或2所述的方法构建的。4.基于双重检测机理构建双响应比率荧光探针的方法，其特征在于：步骤如下：(1)按照权利要求1或2中的方法构建基于银刻蚀的比率荧光探针；(2)在步骤(1)的基于银刻蚀的比率荧光探针中加入H2O2，得到基于双重检测机理构建的双响应比率荧光探针。5.一种基于双重检测机理构建的双响应比率荧光探针，其特征在于：是应用权利要求4的方法构建的。6.权利要求5所述的双响应比率...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐守芳，陆宏志，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东,37