优化的小型抗肌萎缩蛋白基因和表达盒和它们的用途制造技术

本发明专利技术涉及编码小型抗肌萎缩蛋白质的多核苷酸、包含所述多核苷酸的病毒载体，以及使用所述病毒载体将小型抗肌萎缩蛋白递送到细胞或受试者的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】优化的小型抗肌萎缩蛋白基因和表达盒和它们的用途关于联邦赞助的研究和开发的声明本专利技术是在由国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)拨款的基金号AR050595、AR056394和AR056953的政府支持下完成的。政府拥有本专利技术中的某些权利。
本专利技术涉及编码小型抗肌萎缩蛋白质(mini-dystrophinprotein)的多核苷酸、包含所述多核苷酸的病毒载体，以及使用所述病毒载体将小型抗肌萎缩蛋白递送到细胞或受试者的方法。
技术介绍
杜氏肌营养不良症(Duchennemusculardystrophy,DMD)是一种严重的、X染色体连锁的进行性神经肌肉疾病，每3,600到9200个新生男婴中就有约一个受其影响。该病症是因抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因中的移码突变破坏抗肌萎缩蛋白质的表达而导致的。由于缺乏抗肌萎缩蛋白质，骨骼肌以及最终心肌和呼吸肌(例如，肋间肌和膈肌)退化而导致过早死亡。进行性肌无力和肌萎缩始于童年，从小腿和骨盆开始，然后扩散到上臂。其他症状包括某些反射丧失、步态蹒跚、频繁跌倒、难以从坐位或卧位爬起、爬楼梯困难、整体姿本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码小型抗肌萎缩蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸包含：(a)SEQ ID NO:1的核苷酸序列或与其至少约90％同一的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其至少约90％同一的核苷酸序列；或者(c)SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少约90％同一的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.21 US 62/352,675;2017.06.07 US 62/516,4491.一种编码小型抗肌萎缩蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸包含：(a)SEQIDNO:1的核苷酸序列或与其至少约90％同一的核苷酸序列；(b)SEQIDNO:2的核苷酸序列或与其至少约90％同一的核苷酸序列；或者(c)SEQIDNO:3的核苷酸序列或与其至少约90％同一的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述小型抗肌萎缩蛋白质基本上由以下各项组成：N末端、肌动蛋白结合结构域(ABD)、铰链H1、棒R1和R2、铰链H3、棒R22、R23和R24、铰链H4、CR结构域以及野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白质的CT结构域的一部分。3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述小型抗肌萎缩蛋白质基本上由以下各项组成：N末端、ABD、铰链H1、棒R1和R2、棒R22、R23和R24、铰链H4、CR结构域以及野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白质的CT结构域的一部分。4.根据权利要求1-3中的任一项所述的多核苷酸，其中所述小型抗肌萎缩蛋白质不包含野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白质的C末端的最后三个氨基酸残基。5.根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含SEQIDNO:7的氨基酸序列或与其至少约90％同一的氨基酸序列的小型抗肌萎缩蛋白质。6.根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含SEQIDNO:8的氨基酸序列或与其至少约90％同一的氨基酸序列的小型抗肌萎缩蛋白质。7.根据权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸，其与启动子可操作地连接。8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中所述启动子是肌肉特异性启动子。9.根据权利要求7或8所述的多核苷酸，其中所述启动子是肌酸激酶启动子。10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中所述启动子包含SEQIDNO:4的核苷酸序列。11.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中所述启动子包含SEQIDNO:5的核苷酸序列。12.根据权利要求1-11中任一项所述的多核苷酸，其与多腺苷酸化元件可操作地连接。13.根据权利要求12所述的多核苷酸，其中所述多腺苷酸化元件包含SEQIDNO:6的核苷酸序列。14.根据权利要求1-13中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是包含启动子和多腺苷酸化元件的基因表达盒的一部分。15.根据权利要求14所述的多核苷酸，其中所述基因表达盒包含SEQIDNO:9到SEQIDNO:12中任一项的核苷酸序列，或与其至少约90％同一的核苷酸序列。16.一种包含根据权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸的载体。17.根据权利要求16所述的载体，其中所述载体是病毒载体。18.根据权利要求17所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。19.根据权利要求18所述的载体，其中所述AAV载体是AAV9载体。20.一种转化细胞，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸和/或根据权利要求16-19中任一项所述的载体。21.一种转基因动物，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求16-19中任一项所述的载体，和/或根据权利要求20所述的转化细胞。22.一种小型抗肌萎缩蛋白质，其基本上由N末端、ABD、铰链H1、棒R1和R2、铰链H3、棒R22、R23和R24、铰链H4、CR结构域以及野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白质的CT结构域的一部分组成，其中所述小型抗肌萎缩蛋白质不包含野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白质的C末端的最后三个氨基酸残基。23.根据权利要求22所述的小型抗肌萎缩蛋白质，其包含SEQIDNO:7的氨基酸序列或与其至少约90％同一的氨基酸序列。24.一种小型抗肌萎缩蛋白质，其基本上由N末端、ABD、铰链H1、棒R1、R2、R22、R23和R24、铰链H4、CR结构域以及野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白质的CT结构域的一部分组成。25.根据权利要求24所述的小型抗肌萎缩蛋白质，其中所述小型抗肌萎缩蛋白质不包含野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白质的C-末端的最后三个氨基酸残基。26.根据权利要求24或25所述的小型抗肌萎缩蛋白质，其包含SEQIDNO:8的氨基酸序列或与其至少约90％同一的氨基酸序列。27.一种在细胞中产生小型抗肌萎缩蛋白质的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求16-19中任一项所述的载体接触，从而在所述细胞中产生所述小型抗肌萎缩蛋白质。28.一种在受试者中产生小型抗肌萎缩蛋白质的方法，其包括向所述受试者递送根据权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求16-19中任一项所述的载体和/或根据权利要求20所述的转化细胞，从而在所述受试者中产生所述小型抗肌萎缩蛋白质。29.一种治疗有需要的受试者的肌肉萎缩症的方法，其包括向所述受试者递送治疗有效量的根据权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求16-19中任一项所述的载体和/或根据权利要求20所述的转化细胞，从而治疗所述受试者的肌肉萎缩症。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述肌肉萎缩症是杜氏肌营养不良症或贝克型肌肉萎缩症。31.一种重组AAV粒子，其包含AAV衣壳和用于表达人小型抗肌萎缩蛋白质的载体基因组。32.根据权利要求31所述的重组AAV粒子，其中所述AAV衣壳来自AAV9。33.根据权利要求31-32中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述载体基因组包含编码所述人小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化的核酸序列。34.根据权利要求31-33中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述人小型抗肌萎缩蛋白质以从氨基末端到羧基末端的顺序包含来自全长人抗肌萎缩蛋白质的以下亚结构域：N末端肌动蛋白结合结构域、H1、R1、R2、H3、R22、R23、R24、H4、富含半胱氨酸的结构域和不包含野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白中的最后3个氨基酸的羧基末端结构域的一部分。35.根据权利要求31-34中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述N末端肌动蛋白结合结构域由来自SEQIDNO:25的氨基酸编号1-240组成；H1由来自SEQIDNO:25的氨基酸编号253-327组成；R1由来自SEQIDNO:25的氨基酸编号337-447组成；R2由来自SEQIDNO:25的氨基酸编号448-556组成；H3由来自SEQIDNO:25的氨基酸编号2424-2470组成；R22由来自SEQIDNO:25的氨基酸编号2687-2802组成；R23由来自SEQIDNO:25的氨基酸编号2803-2931组成；R24由来自SEQIDNO:25的氨基酸编号2932-3040组成；H4由来自SEQIDNO:25的氨基酸编号3041-3112组成；所述CR结构域由来自SEQIDNO:25的氨基酸编号3113-3299组成；并且所述CT结构域的所述部分由来自SEQIDNO:25的氨基酸编号3300-3408组成。36.根据权利要求31-35中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述人小型抗肌萎缩蛋白质包含SEQIDNO:7的氨基酸序列。37.根据权利要求33-36中任一项所述的重组AAV粒子，其中编码所述人小型抗肌萎缩蛋白质的所述人密码子优化的核酸包含SEQIDNO:1的核酸序列。38.根据权利要求31-37中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述载体基因组进一步包含在编码所述人小型抗肌萎缩蛋白质的所述密码子优化的核酸的侧翼的5′AAV反向末端重复序列(ITR)和3′AAVITR。39.根据权利要求38所述的重组AAV粒子，其中所述AAVITR是AAV2ITR。40.根据权利要求33-39中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述载体基因组进一步包含与所述人密码子优化的核酸序列可操作地连接的肌肉特异性转录调控元件。41.根据权利要求40所述的重组AAV粒子，其中所述肌肉特异性转录调控元件位于5′AAV2ITR与编码所述人小型抗肌萎缩蛋白质的所述人密码子优化的核酸之间。42.根据权利要求40-41中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述肌肉特异性转录调控元件来源于人或小鼠的肌酸激酶基因。43.根据权利要求40-42中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述肌肉特异性转录调控元件包含增强子和启动子。44.根据权利要求40-43中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述肌肉特异性转录调控元件包含SEQIDNO:16的核苷酸序列。45.根据权利要求38-44中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述载体基因组进一步包含在编码所述人小型抗肌萎缩蛋白质的所述密码子优化的核酸的5′末端与所述3′ITR之间的转录终止序列。46.根据权利要求45所述的重组AAV粒子，其中所述转录终止序列包含多腺苷酸化信号序列。47.根据权利要求31-46中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述载体基因组以5'到3'顺序包含：第一AAV2ITR、与编码人小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化的核酸可操作地连接的肌肉特异性转录调控元件、转录终止序列和第二AAV2ITR。48.根据权利要求47所述的重组AAV粒子，其中所述肌肉特异性转录调控元件包含SEQIDNO:16的核苷酸序列。49.根据权利要求47-48中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述人密码子优化的核酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸序列或与其至少95％同一的序列。50.根据权利要求47-49中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述转录终止序列包含SEQIDNO:17的核苷酸序列。51.根据权利要求31-50中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述载体基因组包含SEQIDNO:18的核苷酸序列或其反向互补序列。52.根据权利要求31-50中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述载体基因组基本上由SEQIDNO:18的核苷酸序列或其反向互补序列组成。53.根据权利要求31-50中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述载体基因组由SEQIDNO:18的核苷酸序列或其反向互补序列组成。54.一种重组AAV粒子，其包含AAV9衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含SEQIDNO:18的核苷酸序列或其反向互补序列。55.一种重组AAV粒子，其包含AAV9衣壳和载体基因组，所述载体基因组基本上由SEQIDNO:18的核苷酸序列或其反向互补序列组成。56.一种重组AAV粒子，其包含AAV9衣壳和载体基因组，所述载体基因组由SEQIDNO:18的核苷酸序列或其反向互补序列组成。57.一种药物组合物，其包含根据权利要求31-56中任一项所述的重组AAV粒子和药学上可接受的载剂。58.一种治疗抗肌萎缩蛋白病的方法，其包括向需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求57所述的组合物。59.根据权利要求31-56中任一项所述的重组AAV(rA...

【专利技术属性】
技术研发人员：史考特·W·J·麦克菲，乔春平，李娟，肖啸，马里查·麦金太尔，理查·J·萨谬斯基，
申请(专利权)人：班布疗法公司，北卡罗米纳大学查佩尔希尔分校，
类型：发明
国别省市：美国,US