包含非手性3’-S-或5’-S-硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸合成制造技术

本发明专利技术涉及含有至少一个式(I)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸的制备方法，其中R

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含非手性3’-S-或5’-S-硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸合成本专利技术涉及寡核苷酸特别是含有硫代磷酸酯连接体(linkage)的寡核苷酸、特别是非手性硫代磷酸酯连接体的寡核苷酸的制备方法。本专利技术特别涉及含有至少一个式(I)的非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸的制备方法，所述方法包括使含有式(II)的核苷间连接体的寡核苷酸在碘存在下反应的步骤，其中碘的浓度是大约0.001M至大约0.01M；和其中R1是磷酸酯保护基。寡聚脱氧核苷酸作为治疗剂的应用(其中将众所周知的Watson-Crick杂交原理应用于靶向互补RNA链)自从其在19世纪70年代末期出现以来，已取得了显著进步(P.C.Zamecnik,M.L.Stephenson,PNatlAcadSciUSA1978,75,280-284；S.T.Crooke,Antisensedrugtechnology:principles,strategies,andapplications,第二版，BocaRaton，FL：CRCPress，2008)。随时间推移，已将几种类型的化学修饰引入合成的寡核苷酸中，为了例如延长其半衰期、改善药代动力学、提高RNaseH活性、降低毒性或提高错配识别。最成功的修饰之一是硫代磷酸酯连接体的引入，其中将非桥接的磷酸酯氧原子之一用硫原子代替(F.Eckstein,AntisenseandNucleicAcidDrugDevelopment2009,10,117-121)。所述硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸显示提高的蛋白结合，以及对核分解降解显示明显更高的稳定性，并由此在血浆、组织和细胞中比未修饰磷酸二酯类似物显示实质更高的半衰期。所述保证第一代寡核苷酸疗法的研发，并打开了后代修饰例如锁核酸(LNAs)的大门。然而，用硫代磷酸酯代替磷酸二酯连接体在磷原子处创造了手性中心。因此，直到现在，所有批准的寡核苷酸治疗剂是大量非对映异构体化合物的混合物，所述非对映异构体化合物可能具有不同(并可能相反的)物理化学性质。为了降低所述寡聚脱氧核苷酸的非对映异构的复杂性，硫代磷酸酯内的硫原子理论上可从非桥连位置之一位移至核糖的桥连的3’-位。所述修饰使得围绕磷的取代方式对称，并由此除去手性中心，因此降低分子非对映异构的复杂性。虽然以前已将此类3’-脱氧-3’-巯基-和2’,3’-双脱氧-3’-巯基核苷酸(M.M.Piperakis,J.W.Gaynor,J.Fisher,R.Cosstick,Org.Biomol.Chem.2013,11,966-974；J.Bentley,J.A.Brazier,J.Fisher,R.Cosstick,Org.Biomol.Chem.2007,5,3698-3702；G.Sabbagh,K.J.Fettes,R.Gosain,I.A.O'Neil,R.Cosstick,NucleicAcidsRes.2004,32,495-501；A.P.G.Beevers,K.J.Fettes,G.Sabbagh,F.K.Murad,J.R.P.Arnold,R.Cosstick,J.Fisher,Org.Biomol.Chem.2004,2,114-119)引入到寡聚(脱氧)核苷酸中，但是该修饰既没有描述于治疗剂的情况中，也没有用于降低寡聚脱氧核苷酸硫代磷酸酯的非对映异构复杂性。带有一个或多个修饰的2’,3’-双脱氧-3’-巯基核苷酸的较长寡聚脱氧核苷酸的合成通常通过固相寡核苷酸合成技术实现，所述技术涉及3’-巯基亚磷酰胺结构单元(参见上面的参考文献)。然而，当利用所述修饰的亚磷酰胺时，报道低的偶联效率，致使目标产物的产率低。因此，以前的优化努力通常集中于偶联条件(试剂浓度、偶联时间、活化剂或添加剂)，但是没有发现显著改善合成效率的一套通用条件。我们证实将2’-3’-双脱氧-3’-巯基-亚磷酰胺引入到较长模型的寡聚脱氧核苷酸中是困难的。此外，我们还发现后续的氧化是令人吃惊地困难的。这在很大程度上造成观察到的低合成效率。在标准条件下，通常将相当高浓度的碘溶液用作氧化剂(经常0.1M高)。然而，在这些条件下，寡核苷酸5’-末端载有另外的磷酸基的缺失片段通常作为副产物而观察到(经常与目标产物等量)。相反，令人吃惊地发现利用非常低浓度的碘作为氧化剂(通常比本领域已知的标准条件下的浓度低至少50倍)，可以以显著程度抑制竞争性副产物的形成。现在，这些新氧化条件的应用保证将2’,3’-双脱氧-3’-巯基修饰高效引入到寡核苷酸中。可理解的是上文定义的式(I)硫代磷酸酯核苷间连接体在最终的、脱保护的寡核苷酸(即当R1是氢时)中是非手性的。然而，甚至当R1不是氢时，作为非手性连接体的前体，式(I)硫代磷酸酯核苷间连接体在本说明书中将被称为非手性的硫代磷酸酯核苷间连接体。在本说明书中，单独或组合的术语“烷基”表示具有1-8个碳原子的直链或支链烷基，特别是具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，并更特别是具有1-3个碳原子的直链或支链烷基。直链和支链C1-C8烷基的示例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基的异构体、己基的异构体、庚基的异构体和辛基的异构体，特别是甲基、乙基、丙基、丁基和戊基，并更特别是甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、叔丁基和异戊基。烷基的特别示例是甲基、乙基和丙基。单独或组合的术语“烷氧基”或“烷基氧基”表示式烷基-O-基团，其中术语“烷基”具有上文给定的含义，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。特别的“烷氧基”是甲氧基和乙氧基。单独或组合的术语“羟基”表示-OH基团。单独或组合的术语“硫羟基”表示-SH基团。单独或组合的术语“氨基”表示伯氨基基团(-NH2)、仲氨基基团(-NH-)或叔氨基基团(-N-)。单独或组合的术语“硫烷基”表示-S-基团。单独或组合的术语“叠氮基”表示-N3基团。单独或组合的术语“氧基”表示-O-基团。单独或组合的术语“保护基”表示通过官能团的化学修饰而引入到分子中以在随后的化学反应中获得立体选择性的基团。“磷酸酯保护基”是磷酸酯基团的保护基。磷酸酯保护基的示例是2-氰乙基和甲基。磷酸酯保护基的特别示例是2-氰乙基。“羟基保护基”是羟基的保护基，并还用于保护巯基基团。羟基保护基的示例是乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基(或双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(DMT)、三甲氧基三苯甲基(或三-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(TMT)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基(MMT)、p-甲氧基苄基醚(PMB)、甲硫基甲基醚、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯甲基或三苯基甲基(Tr)、甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三-异-丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚)、甲基醚和乙氧基乙基醚(EE)。羟基保护基的特别示例是DMT和TMT，特别是DMT。“硫羟基保护基”是硫羟基基团的保护基。硫羟基保护基的示例是“羟基保护基”的那些。术语“核碱基”指核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.含有至少一个式(I)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸的制备方法，

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.27 IN 2016410256471.含有至少一个式(I)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸的制备方法，所述方法包括含有式(II)核苷间连接体的寡核苷酸在碘存在下反应的步骤，其中碘的浓度是大约0.001M至大约0.01M；且其中R1是磷酸酯保护基。2.根据权利要求1的方法，其中所述至少一个式(I)或式(II)的非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的硫原子连接至所述寡核苷酸的相邻核苷的3’碳原子或5’碳原子。3.根据权利要求1或2的方法，其中根据权利要求1定义的含有至少一个式(I)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸包含式(III)片段，其中X1是氧或硫；Y1是氧或硫；前提是X1和Y1不同时为硫；各个R1独立地如权利要求1中所定义；R2a是氢、羟基、氟、烷基、烷氧基、烷氧基烷氧基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、烷基羰基氨基、叠氮基、-SH、-CN、-CF3、-OCF3、烷基硫烷基烷氧基、氨基氧基烷氧基、烷基氨基氧基烷氧基、二烷基氨基氧基烷氧基、氨基羰基烷氧基、烷基氨基羰基烷氧基或二烷基氨基羰基烷氧基；R4a是氢或羟基烷基；或者R2a和R4a一起形成-CH2O-、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2N(ORp)-、-CHCH3O-、-C(CH3)2O-、-CH2C(＝CH2)-、-CHCH3C(＝CH2)-、-CHCH3S-、-CH2NRp-、-CH2CH2O-、-CH2CH2CH2O-、-CH2OCH2-、-CH(CH2OCH3)O-、-CH(CH2CH3)O-或-CH2OCH2O-；前提是当Y1是硫时，则R4a是氢；R2b是氢、羟基、氟、烷基、烷氧基、烷氧基烷氧基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、烷基羰基氨基、叠氮基、-SH、-CN、-CF3、-OCF3、烷基硫烷基烷氧基、氨基氧基烷氧基、烷基氨基氧基烷氧基、二烷基氨基氧基烷氧基、氨基羰基烷氧基、烷基氨基羰基烷氧基或二烷基氨基羰基烷氧基；R3是羟基保护基；各个Rp独立地是烷基；且各个Nu独立地是核碱基。4.根据权利要求1-3中任何一项的方法，其中含有根据权利要求1定义的式(II)核苷间连接体的寡核苷酸包含式(IV)片段，其中X1、Y1、R1、R2a、R2b、R3、R4a和Nu同权利要求3中定义的。5.根据权利要求3-4中任何一项的方法，其中根据权利要求3定义的含有至少一个式(I)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸在酸存在下反应，得到含有式(V)片段的寡核苷酸，其中X1、Y1、R1、R2a、R2b、R4a和Nu同权利要求3中定义的。6.根据权利要求5的方法，其中如权利要求5中定义的含有式(V)片段的寡核苷酸在式(VI)化合物存在下反应，得到根据权利要求1所述的含有至少一个式(I)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸，其含有式(VII)片段，其中Y2是氧或硫；R2c是氢、羟基、氟、烷基、烷氧基、烷氧基烷氧基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、烷基羰基氨基、叠氮基、-SH、-CN、-CF3、-OCF3、烷基硫烷基烷氧基、氨基氧基烷氧基、烷基氨基氧基烷氧基、二烷基氨基氧基烷氧基、氨基羰基烷氧基、烷基氨基羰基烷氧基或二烷基氨基羰基烷氧基；R4c是氢或羟基烷基；或者R2c和R4c一起形成-CH2O-、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2N(ORp)-、-CHCH3O-、-C(CH3)2O-、-CH2C(＝CH2)-、-CHCH3C(＝CH2)-、-CHCH3S-、-CH2NRp-、-CH2CH2O-、-CH2CH2CH2O-、-CH2OCH2-、-CH(CH2OCH3)O-、-CH(CH2CH3)O-或-CH2OCH2O-；前提是当Y2是硫时，则R4c是氢；R5是二烷基氨基；各个Rp独立地是烷基；且X1、Y1、R1、R2a、R2b、R3、R4a和Nu同权利要求3中定义的。7.根据权利要求6的方法，其中根据权利要求6定义的含有式(VII)片段的寡核苷酸在硫氧化剂或碘存在下反应，其中碘的浓度是大约0.001M至大约0.01M，得到根据权利要求1定义的含有至少一个式(I)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸，其含有式(VIII)片段，其中X2是氧或硫；Y2是氧或硫；前提是X2和Y2不同时是硫；且其中X1、Y1、R1、R2a、R2b、R3、R4a和Nu同权利要求3中定义的，并且R2c和R4c同权利要求6中定义的。8.根据权利要求7的方法，其中当Y2是氧时，权利要求6定义的含有式(VII)片段的寡核苷酸在硫氧化剂存在下反应。9.根据权利要求7的方法，其中当Y2是硫时，权利要求6定义的含有式(VII)片段的寡核苷酸在碘存在下反应。10.根据权利要求1或2的方法，其中根据权利要求1定义的含有至少一个式(I)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸包含式(IX)片段，其中X1是氧或硫；Y1是氧或硫；各个R1独立地同权利要求1所定义的；R2a是氢、羟基、氟、烷基、烷氧基、烷氧基烷氧基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、烷基羰基氨基、叠氮基、-SH、-CN、-CF3、-OCF3、烷基硫烷基烷氧基、氨基氧基烷氧基、烷基氨基氧基烷氧基、二烷基氨基氧基烷氧基、氨基羰基烷氧基、烷基氨基羰基烷氧基或二烷基氨基羰基烷氧基；R4a是氢或羟基烷基；或者R2a和R4a一起形成-CH2O-、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2N(ORp)-、-CHCH3O-、-C(CH3)2O-、-CH2C(＝CH2)-、-CHCH3C(＝CH2)-、-CHCH3S-、-CH2NRp-、-CH2CH2O-、-CH2CH2CH2O-、-CH2OCH2-、-CH(CH2OCH3)O-、-CH(CH2CH3)O-或-CH2OCH2O-；R2b是氢、羟基、氟、烷基、烷氧基、烷氧基烷氧基、-NH2、烷基氨基、二烷基氨基、烷基羰基氨基、叠氮基、-SH、-CN、-CF3、-OCF3、烷基硫烷基烷氧基、氨基氧基烷氧基、烷基氨基氧基烷氧基、二烷基氨基氧基烷氧基、氨基羰基烷氧基、烷基氨基羰基烷氧基或二烷基氨基羰基烷氧基；R4b是氢或羟基烷基；或者R2b和R4b一起形成-CH2O-、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2N(ORp)-、-CHCH3O-、-C(CH3)2O-、-CH2C(＝CH2)-、-CHCH3C(＝CH2)-、-CHCH3S-、-CH2NRp-、-CH2CH2O-、-CH2CH2CH2O-、-CH2OCH2-、-CH(CH2OCH3)O-、-CH(CH2CH3)O-或-CH2OCH2O-；R3是羟基保护基或硫羟基保护基；各个Rp独立地是烷基；且各个Nu独立地是核碱基。11.根据权利要求1、2和10中任何一项所述的方法，其中权利要求1定义的含有式(II)核苷间连接体的寡核苷酸包含式(X)片段，其中X1、Y1、R1、R2a、R2b、R3、R4a、R4b和Nu同权利要求10中定义的。12.根据权利要求10或11所述的方法，其中根据权利要求10中定义的含有至少一个式(I)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸在酸存在下反应，得到含有式(XI)片段的寡核苷酸，其中X1、Y1、R1、R2a、R2b、R4a、R4b和Nu同权利要求10中定义的。13.根据权利要求12的方法，其中权利要求12定义的含有式(XI)片段的寡核苷酸在式(XII)化合物...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·布莱谢尔，J·杜施梅尔，G·萨哈，J·A·沙科赫，
申请(专利权)人：罗氏创新中心哥本哈根有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK