新的pRNA三向接合制造技术

描述了源自phi29、M2、SF5和GA1 pRNA并具有高稳定性的三向接合(3WJ) RNA支架。pRNA 3WJ支架可用于形成为治疗和/或诊断功能而递送活性剂的化合物、缀合物、组合物和纳米颗粒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新的pRNA三向接合相关申请的交叉引用本申请要求2016年2月26日提交的美国临时申请号62/300,517的优先权，其明确地通过引用以其整体结合到本文中。政府资助本专利技术在由美国国家科学基金会(NationalScienceFoundation)授予的资助号2012174160和0844913的政府资助下完成。政府对本专利技术具有一定权利。背景之前的研究已经证明，包装(或前头)核糖核酸(pRNA)三向接合(3WJ)基序在生物技术中具有应用，例如靶向人免疫缺陷病毒(HIV)和癌症。例如，phi29噬菌体pRNA3WJ纳米基序已被广泛研究，和在具有例如癌症靶向功能的纳米结构的合理设计中成功地用作结构单元(例如参见美国专利9,297,013B2)。附图简述本公开内容的数个实施方案在附图中藉此说明。然而应注意，附图仅说明了数个实施方案，因此不意图视为限制本公开内容的范围。图1A描述了前头或包装RNA(pRNA)的球棍模型，其中球代表环和棍代表螺旋。中央的三向接合(3WJ)部分，其不包括A、CE和D凸起，在盒内呈现。3WJ可从以近似等摩尔浓度混合的三个单一RNA寡核苷酸链(表示为3WJa、3WJb和3WJc)装配。pRNA3WJ纳米基序插入物包含链3WJa、3WJb和3WJc，它们根据Watson-Crick碱基配对进行碱基配对，除了某些不配对核苷酸之外；图1B表明当碱基配对为3WJ构建体时，每个3WJa、3WJb和3WJc寡核苷酸链的5’-3’方向；图2显示phi29和GA1pRNA3WJ构建体的一级和二级结构。不形成Watson-Crick碱基对的核苷酸显示为单碱基。phi29构建体包含SEQIDNO:1-3。GA1构建体包含SEQIDNO:4-6；图3显示SF5和M2pRNA3WJ构建体的一级和二级结构。不形成Watson-Crick碱基对的核苷酸显示为单碱基。SF5构建体包含SEQIDNO:7-9。M2构建体包含SEQIDNO:10-12；图4A显示以31.2µM收集的图2的phi293WJ构建体的非线性解链曲线拟合(R2>0.99)，表明急剧的协作转变。数据点以6/s的速率收集，加热速率为1℃/min；图4B是phi293WJ解链数据(R2>0.99)的van’tHoff曲线图，其中斜率是–∆H/R和y-截距是∆S/R。数据使用Marquardt-Levenberg方法在Meltwin中拟合；图5A显示使用RNAStructure、RNAfold、mfold和RNAsoft预测的以及实验测量的各种pRNA3WJ构建体(母体phi29、GA1、SF5、M2)的热力学稳定性。-△G越大表明稳定性越大。*由于计算机运行时间限制，RNAsoft未输出对于GA1pRNA3WJ的二级结构自由能；图5B显示使用RNAStructure、RNAfold、mfold和RNAsoft预测的以及实验测量的各种phi29pRNA3WJ突变体构建体的热力学稳定性。-△G越大表明稳定性越大；图6A比较使用图5A-5B的程序预测的和实验测量的各种pRNA3WJ(phi29、GA1、SF5、M2)的热力学稳定性。-△G越大表明稳定性越大。*由于计算机运行时间限制，RNAsoft未输出GA1pRNA3WJ的二级结构自由能；图6B比较使用图5A-5B的程序预测的和实验测量的各种phi29pRNA突变体3WJ的热力学稳定性。-△G越大表明稳定性越大；图7显示金属离子对四种pRNA3WJ构建体的影响。在100mMNa+和10mMMg2+中GA13WJ的光学解链不满足≥0.90的van’tHoff曲线线性拟合度截止标准；图8显示50bp梯(泳道i和viii)、phi29链3WJa(泳道ii)、phi29链3WJa+3WJb(泳道iii)、phi293WJ构建体(泳道iv)、GA13WJ构建体(泳道v)、SF53WJ构建体(泳道vi)、M23WJ构建体(泳道vii)、phi29∆U29构建体(泳道ix)、phi29∆U29/∆U72构建体(泳道x)、phi29∆U29/∆U72-73构建体(泳道xi)、phi29∆U29/∆U72-73-74构建体(泳道xii)、phi29∆U72构建体(泳道xiii)、phi29∆U72-73构建体(泳道xiv)和phi29∆U72-73-74构建体(泳道xv)的凝胶迁移率。在标准解链缓冲液(1M氯化钠、10mM二甲胂酸钠、0.5mMEDTA、pH7)中进行装配以证实在光学解链条件下3WJ构建体的形成。Phi29链3WJa(泳道ii)和链3WJa+3WJb(泳道iii)作为参考包括在内。所有3WJ构建体以近似相同的速率运行；图9显示使用由(A)Gu和Schroeder(GuX,SchroederS.2011.DifferentsequencesshowsimilarquaternaryinteractionstabilitiesinproheadviralRNAself-assembly.JournalofBiologicalChemistry286:14419-14426)和(B)Hao和Kieft(HaoY,KieftJS.2014.Diverseself-associationpropertieswithinafamilyofphagepackagingRNAs.RNA20:1-16)报道的序列的NearestNeighborDatabase计算的联锁环稳定性提供的实验3WJ数据。提供每个pRNA的联锁环序列。确定在1M氯化钠中的RNA的实验稳定性数据和计算稳定性数据二者；图10A显示在10-分钟暴露于100-倍稀释的人血清后，在TAE缓冲液中用溴化乙锭染色的2%(w/v)琼脂糖中10μM装配3WJ构建体的凝胶迁移率。所有反应在37°C进行。泳道(i)50bpDNA梯、(ii)在标准解链缓冲液中的phi293WJ构建体+1个单位RNA酶T1(阳性降解对照)、(iii)phi293WJ构建体、(iv)GA13WJ构建体、(v)SF53WJ构建体、(vi)M23WJ构建体、(vii)phi29∆U29/∆U72-733WJ构建体、(viii)phi29∆U29/∆U72-73-743WJ构建体；图10B显示在10-分钟暴露于来自第二血液供体的100-倍稀释的人血清后，在TAE缓冲液中用溴化乙锭染色的2%(w/v)琼脂糖中10μM装配3WJ构建体的另外的凝胶迁移率结果。所有反应在37°C进行。泳道(i)50bpDNA梯、(ii)在标准解链缓冲液中的phi293WJ构建体(阴性降解对照)、(iii)phi293WJ构建体、(iv)M23WJ构建体、(v)SF53WJ构建体、(vi)SF5∆G313WJ构建体、(vii)SF5∆G693WJ构建体、(viii)SF5∆G31/∆G693WJ构建体；图11显示在暴露于1000-倍稀释的人血清中10分钟、30分钟和1小时后，在TAE缓冲液中用溴化乙锭染色的2%(w/v)琼脂糖中10μMphi29、SF5和M2装配的3WJ构建体的凝胶迁移率的比较。所有反应在37°C进行。泳道(i)50bpDNA梯、(ii)在标准解链缓冲液(1M氯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种RNA接合支架，包含：三向接合(3WJ)结构域，所述3WJ结构域包含：包含第一RNA多核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA多核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA多核苷酸的3WJc序列，其中所述3WJ结构域的第一分支由所述3WJa序列的5’部分和所述3WJc序列的3’部分形成并包含第一螺旋区，所述3WJ结构域的第二分支由所述3WJa序列的3’部分和所述3WJb序列的5’部分形成并包含第二螺旋区，和所述3WJ结构域的第三分支由所述3WJb序列的3’部分和所述3WJc序列的5’部分形成并包含第三螺旋区，其中所述螺旋区各自包含形成标准的Watson‑Crick键的多个RNA核苷酸对，和其中(i) 所述3WJa序列不存在位于所述第一螺旋区和所述第二螺旋区之间的不配对核苷酸，和两个不配对核苷酸位于所述第二分支的所述3WJa序列中，和(ii) 两个相邻的不配对核苷酸位于所述第一螺旋区和所述第三螺旋区之间的所述3WJc序列中，和一个不配对核苷酸位于所述第二螺旋区和所述第三螺旋区之间的所述3WJb序列中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.26 US 62/3005171.一种RNA接合支架，包含：三向接合(3WJ)结构域，所述3WJ结构域包含：包含第一RNA多核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA多核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA多核苷酸的3WJc序列，其中所述3WJ结构域的第一分支由所述3WJa序列的5’部分和所述3WJc序列的3’部分形成并包含第一螺旋区，所述3WJ结构域的第二分支由所述3WJa序列的3’部分和所述3WJb序列的5’部分形成并包含第二螺旋区，和所述3WJ结构域的第三分支由所述3WJb序列的3’部分和所述3WJc序列的5’部分形成并包含第三螺旋区，其中所述螺旋区各自包含形成标准的Watson-Crick键的多个RNA核苷酸对，和其中(i)所述3WJa序列不存在位于所述第一螺旋区和所述第二螺旋区之间的不配对核苷酸，和两个不配对核苷酸位于所述第二分支的所述3WJa序列中，和(ii)两个相邻的不配对核苷酸位于所述第一螺旋区和所述第三螺旋区之间的所述3WJc序列中，和一个不配对核苷酸位于所述第二螺旋区和所述第三螺旋区之间的所述3WJb序列中。2.权利要求1的RNA接合支架，其中所述3WJa序列包含SEQIDNO:73，所述3WJb序列包含SEQIDNO:74，和所述3WJc序列包含SEQIDNO:75。3.权利要求1的RNA接合支架，其中所述第二分支在分别对应于野生型M2pRNA的位置36和37的不配对腺嘌呤和尿嘧啶核苷酸的位置处不存在相邻的不配对核苷酸，和其中所述第三分支在对应于所述野生型M2pRNA的位置79的不配对腺嘌呤核苷酸的位置处不存在不配对核苷酸。4.权利要求1的RNA接合支架，其在所述3WJa序列中存在的两个不配对核苷酸的下游的所述3WJa序列中不存在一个或多个不配对核苷酸。5.权利要求1的RNA接合支架，其在所述3WJb序列中存在的不配对核苷酸的下游的所述3WJb序列中不存在不配对核苷酸。6.权利要求1的RNA接合支架，其在所述3WJa序列中存在的两个不配对核苷酸的下游的所述3WJa序列中不存在一个或多个不配对核苷酸，和在所述3WJb序列中存在的不配对核苷酸的下游的所述3WJb序列中不存在不配对核苷酸。7.一种缀合物，包含权利要求1的RNA3WJ支架，所述支架与至少一个选自治疗性药物、抗体、标记物、染料、siRNA、核酶、核糖开关和适体的部分连接。8.一种组合物，包含权利要求7的缀合物和药学上可接受的媒介、载体或稀释剂。9.一种RNA接合支架，包含：三向接合(3WJ)结构域，所述3WJ结构域包含：包含第一RNA多核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA多核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA多核苷酸的3WJc序列，其中所述3WJ结构域的第一分支由所述3WJa序列的5’部分和所述3WJc序列的3’部分形成并包含第一螺旋区，所述3WJ结构域的第二分支由所述3WJa序列的3’部分和所述3WJb序列的5’部分形成并包含第二螺旋区，和所述3WJ结构域的第三分支由所述3WJb序列的3’部分和所述3WJc序列的5’部分形成并包含第三螺旋区，其中所述螺旋区各自包含形成标准的Watson-Crick键的多个RNA核苷酸对，和其中(i)所述3WJa序列不存在位于所述第一螺旋区和所述第二螺旋区之间的不配对核苷酸，和一个不配对核苷酸位于所述第二分支的所述3WJa序列中，和(ii)两个相邻的不配对核苷酸位于所述第二螺旋区和所述第三螺旋区之间的所述3WJb序列中。10.一种缀合物，包含权利要求9的RNA3WJ支架，所述支架与至少一个选自治疗性药物、抗体、标记物、染料、siRNA、核酶、核糖开关和适体的部分连接。11.一种RNA接合支架，包含：三向接合(3WJ)结构域，所述3WJ结构域包含：包含第一RNA多核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA多核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA多核苷酸的3WJc序列，其中所述3WJ结构域的第一分支由所述3WJa序列的5’部分和所述3WJc序列的3’部分形成并包含第一螺旋区，所述3WJ结构域的第二分支由所述3WJa序列的3’部分和所述3WJb序列的5’部分形成并包含第二螺旋区，和所述3WJ结构域的第三分支由所述3WJb序列的3’部分和所述3WJc序列的5’部分形成并包含第三螺旋区，其中所述螺旋区各自包含形成标准的Watson-Crick键的多个RNA核苷酸对，和其中所述3WJa序列不存在位于所述第一螺旋区和所述第二螺旋区之间的不配对核苷酸，和不存在以下的至少一项：(1)在对应于野生型SF5pRNA的位置31的不配对鸟嘌呤核苷酸的位置处的不配对核苷酸，和(2)在对应于所述野生型SF5pRNA的位置69的不配对鸟嘌呤核苷酸的位置处的不配对核苷酸。12.权利要求11的RNA接合支架，其在对应于野生型SF5pRNA的位置31的不配对鸟嘌呤核苷酸的位置处不存在不配对核苷酸。13.权利要求12的RNA接合支架，其中所述3WJa序列包含SEQIDNO:86，所述3WJb序列包含SEQIDNO:87，和所述3WJc序列包含SEQIDNO:88。14.权利要求11的RNA接合支架，其在对应于所述野生型SF5pRNA的位置69的不配对鸟嘌呤核苷酸的位置处不存在不配对核苷酸。15.权利要求14的RNA接合支...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿利萨·C·希尔，SJ施勒德，
申请(专利权)人：俄克拉何马大学董事会，阿利萨·C·希尔，
类型：发明
国别省市：美国,US