一种生产依诺肝素钠使用的原料肝素钠制造技术

本发明专利技术涉及肝素钠技术领域，尤其为一种生产依诺肝素钠使用的原料肝素钠，采用相关系数法筛选制备依诺肝素钠的肝素钠原料，其具体步骤为：肝素钠酶解；分离分析；结果计算。本发明专利技术采用相关系数法筛选制备依诺肝素钠的肝素钠原料，相关表和相关图可反映两个变量之间的相互关系及其相关方向。相关系数是用以反映变量之间相关关系密切程度的统计指标。由相关系数衡量肝素钠与依诺肝素钠制备之间的关系更加的准确快捷，同时本发明专利技术采用统计学的相关系数法进行筛选不仅可以计算已知结构的二糖及四糖还可以将降解后未知结构的多糖囊括在内，更加的全面可靠，结果不会受到检测人员及环境的影响，更加的科学，准确率更高。

【技术实现步骤摘要】
一种生产依诺肝素钠使用的原料肝素钠
本专利技术涉及肝素钠
，具体为一种生产依诺肝素钠使用的原料肝素钠。
技术介绍
肝素钠是粘多糖硫酸酯类抗凝血药，目前肝素是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗，其中，其在血液透析治疗中是唯一有效的特效药物。临床应用及研究显示，肝素除具有抗凝血作用外，还具有其他多种生物活性和临床用途，包括降血脂作用、抗中膜平滑肌细胞(SMC)增生、促进纤维蛋白溶解等作用。此外，依诺肝素钠是由肝素原料药作为原料进一步加工成的一大类抗血栓的药物，具有更为广泛的临床医学用，成为治疗急性静脉血栓和急性冠脉综合症(心绞痛、心肌梗塞)等疾病的首选药物，并且安全性更高，副作用更小。肝素钠天然存在肥大细胞，主要从猪小肠粘膜提取。生产企业首先需要从生猪小肠粘膜中提取并制成肝素粗品，因肝素粗品中含有杂蛋白，不能直接应用于临床治疗，需进一步提取纯化加工成肝素原料药。由猪小肠提取的肝素钠粗品。由猪肠粘膜提取粗品肝素钠时，由于提取方法各个企业千差万别，有酶解法、有盐解法等从而导致粗品肝素钠质量差异很大；在由粗品肝素钠提纯精品肝素钠的时候，也有许多方法，如调酸调碱过滤法、离子交换法、盐解法、氧化法等等，其提纯方法和工艺参数的差别，对精品肝素钠的质量具有十分重要的影响。而精品肝素钠的质量又决定着使用其制作低分子量肝素依诺肝素钠的质量，所以如何选取适合依诺肝素钠生产使用的精品肝素钠是摆在业界遇到的问题，选择好的质量的精品肝素钠，不仅使其制作成的依诺肝素钠的质量优越，而且产品的收率也可以得到提高，反之，则依诺肝素钠的质量达不到要求，并且收率也会降低。本说明书旨在提供一种对精品肝素钠的检测方法，其方法可以保障用本技术选择的精品肝素钠更好地生产出优质的依诺肝素钠。申请公布号CN104193849A的一种依诺肝素钠的生产方法中针对依诺肝素钠所使用的精品肝素钠的选取做了限定，但只从几种二糖和四糖结构的百分含量对原料肝素钠进行筛选，由于肝素钠包含的糖结构种类较多，已知结构的二糖和四糖百分含量在0.1％-70％不等，个别二糖含量很低，液相同一样品连续进样的误差也只能控制在1.0％左右，因此百分含量的检测的结果会受到仪器灵敏度及操作人员的误差影响，重现性较差容易出现误差，甄选结果不准确影响低分子肝素钠的制备，造成资源浪费及工艺的不稳定性。同时该专利技术只是应用了已知结构的二糖及四糖进行计算，而在降解后肝素钠会生成大量的未知结构的糖片段未被考虑在内，结果覆盖性窄，不能够全面的反应肝素钠糖结构与依诺肝素钠制备之间的关系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生产依诺肝素钠使用的原料肝素钠，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。该生产依诺肝素钠使用的原料肝素钠快，捷且全面的原料筛选法，较好地解决了依诺肝素钠使用的原料肝素钠的筛选问题。本专利技术全面科学，不仅能够保证产品的安全性、有效性，而且能够避免肝素钠原料的浪费，提高生产效率。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种生产依诺肝素钠使用的原料肝素钠，采用相关系数法筛选制备低分子肝素钠的肝素钠原料，其具体步骤为：1)肝素钠原料标准数据的确定：用若干批次肝素钠原料制成依诺肝素钠，选取合格的依诺肝素钠所使用的肝素钠原料5～10批次，通过酶解、分离分析，确定肝素钠原料标准数据；2)取待测肝素钠原料，通过酶解、分离分析，记录待测肝素钠样品图谱；3)将待测肝素钠样品图谱与肝素钠原料标准图谱进行比较，采用相关系数法筛选制备低分子肝素钠的肝素钠原料。进一步的，步骤1)中：a.肝素钠酶解：将肝素钠原料药配置成水溶液，向其中加入一定量的醋酸钠钙溶液，混匀后向其加入含有肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III的混合肝素酶溶液，轻轻翻转混匀，在25℃水浴中恒温48小时以上，获得肝素钠的酶解液，再往酶解液中加入一定量的硼氢化钠溶液，放置至少4小时，得到还原后的肝素钠酶解液；b.分离分析：将步骤a中所述还原后的肝素钠酶解溶液注入HPLC中进行检测，记录色谱图，根据肝素钠的二糖和四糖的保留时间，确定待测肝素钠中的二糖和四糖的种类，并根据5～10批次肝素钠原料谱图中的每个糖的峰面积计算平均峰面积，确定标准数据。进一步的，步骤2)中：a1.肝素钠酶解：将待测肝素钠原料药配置成水溶液，向其中加入一定量的醋酸钠钙溶液，混匀后向其加入含有肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III的混合肝素酶溶液，轻轻翻转混匀，在25℃水浴中恒温48小时以上，获得肝素钠的酶解液，再往酶解液中加入一定量的硼氢化钠溶液，放置至少4小时，得到还原后的肝素钠酶解液；b1.分离分析：将步骤a1中所述还原后的肝素钠酶解溶液注入HPLC中进行检测，记录色谱图，根据肝素钠的二糖和四糖的保留时间，确定待测肝素钠中的二糖和四糖的种类。进一步的，步骤a、步骤a1中：a2.待测肝素钠溶液配制：精密量取肝素钠20mg，置于离心管内，加入1mL水，涡旋溶解，制成20mg/mL的溶液；b2.醋酸钠钙溶液配制：取牛血清白蛋白10mg，醋酸钙32mg，加水60mL溶解，加冰醋酸580μL，用2mol/l氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，全量转移至100mL量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，用0.45μm滤膜过滤后即的；c.肝素酶I、II和III混合液配制：取肝素酶I、II和III各适量，分别用pH7.0的磷酸钾缓冲液，溶解并制成每1mL中含0.4IU的溶液，分别取3种肝素酶溶液，按1∶1∶1的比例等体积混合，摇匀，即得；d.硼氢化钠溶液配制：取硼氢化钠12mg，加水400μL使溶解，涡旋混匀，即得，临用新制；e.肝素钠酶解反应：取a步骤制得的溶液20μL，分别加入醋酸钙溶液70μL和肝素酶I、II和III混合液100μL，轻轻翻转混匀，在25℃水浴中恒温48小时以上，得到肝素钠酶解液；f.酶解液还原反应：取e步骤制得的酶解液各60μL，分别加入硼氢化钠溶液10μL，混匀，放置至少4小时，得到还原后的肝素钠酶解液。进一步的，步骤f中加入磷酸钾缓冲液，其配制为：取磷酸二氢钾68mg，牛血清白蛋白10mg，加水30mL溶解，用氢氧化钾试液调节pH值至7.0，全量转移至50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用0.45μm滤膜过滤后即得。进一步的，步骤b、步骤b1中：检测条件为：色谱柱为强阴离子交换树脂，柱温50℃，流速为每分钟0.8mL；以高氯酸钠磷酸二氢钠溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度如下表；进一步的，步骤b、步骤b1中：a3.流动相配制：流动相A：精密称取磷酸二氢钠0.280g，加水950m使溶解，用磷酸调节pH值至3.0，加水稀释至1000mL，即得；流动相B：精密称取高氯酸钠140g，加流动相A950mL使溶解，用磷酸调节pH值至3.0，用流动相A稀释至1000mL，即得；b3.色谱分析条件：仪器为高效液相色谱仪，色谱柱为强阴离子交换树脂，检测器为紫外检测器，柱温50℃，流速为每分钟0.8mL；检测波长为234nm；进样量10μL，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，洗脱梯度见下表：c1.分离解析：分别将b3中获得的还原后的肝素钠酶解液注入液相色谱仪，记录色谱图。进一步的，步骤3)中：根据步骤b、步骤b1中所得的液相色谱图，由以下公式计算相关系数，通过相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产依诺肝素钠使用的原料肝素钠，其特征在于，采用相关系数法筛选制备依诺肝素钠的肝素钠原料；1)肝素钠原料标准数据的确定：用若干批次肝素钠原料制成依诺肝素钠，选取合格的依诺肝素钠所使用的肝素钠原料5～10批次，通过酶解、分离分析，确定肝素钠原料标准数据；2)取待测肝素钠原料，通过酶解、分离分析，记录待测肝素钠样品图谱；3)将待测肝素钠样品图谱与肝素钠原料标准图谱进行比较，采用相关系数法筛选制备低分子肝素钠的肝素钠原料。

【技术特征摘要】
1.一种生产依诺肝素钠使用的原料肝素钠，其特征在于，采用相关系数法筛选制备依诺肝素钠的肝素钠原料；1)肝素钠原料标准数据的确定：用若干批次肝素钠原料制成依诺肝素钠，选取合格的依诺肝素钠所使用的肝素钠原料5～10批次，通过酶解、分离分析，确定肝素钠原料标准数据；2)取待测肝素钠原料，通过酶解、分离分析，记录待测肝素钠样品图谱；3)将待测肝素钠样品图谱与肝素钠原料标准图谱进行比较，采用相关系数法筛选制备低分子肝素钠的肝素钠原料。2.根据权利要求1所述的一种生产依诺肝素钠使用的原料肝素钠，其特征在于，步骤1)中：a.肝素钠酶解：将肝素钠原料配置成水溶液，向其中加入一定量的醋酸钠钙溶液，混匀后向其加入含有肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III的混合肝素酶溶液，轻轻翻转混匀，在25℃水浴中恒温48小时以上，获得肝素钠的酶解液，再往酶解液中加入一定量的硼氢化钠溶液，放置至少4小时，得到还原后的肝素钠酶解液；b.分离分析：将步骤a中所述还原后的肝素钠酶解溶液注入HPLC中进行检测，记录色谱图，根据肝素钠的二糖和四糖的保留时间，确定待测肝素钠中的二糖和四糖的种类，并根据5～10批次肝素钠原料谱图中的每个糖的峰面积计算平均峰面积，确定标准数据。3.根据权利要求2所述的一种生产依诺肝素钠使用的原料肝素钠，其特征在于，步骤2)中：a1.肝素钠酶解：将待测肝素钠原料配置成水溶液，向其中加入一定量的醋酸钠钙溶液，混匀后向其加入含有肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III的混合肝素酶溶液，轻轻翻转混匀，在25℃水浴中恒温48小时以上，获得肝素钠的酶解液，再往酶解液中加入一定量的硼氢化钠溶液，放置至少4小时，得到还原后的肝素钠酶解液；b1.分离分析：将步骤a1中所述还原后的肝素钠酶解溶液注入HPLC中进行检测，记录色谱图，根据肝素钠的二糖和四糖的保留时间，确定待测肝素钠中的二糖和四糖的种类。4.根据权利要求3所述的一种生产依诺肝素钠使用的原料肝素钠，其特征在于，步骤3)中：根据步骤b、步骤b1中所得的液相色谱图，由以下公式计算相关系数，通过相关系数即可以筛选出合适的依诺肝素钠使用的肝素钠原料；5.根据权利要求3所述的一种生产依诺肝素钠使用的原料肝素钠，其特征在于，步骤a、步骤a1中：a2.肝素钠溶液配制：精密量取肝素钠20mg，置于离心管内，加入1mL水，涡旋溶解，制成20mg/mL的溶液；b2.醋酸钠钙溶液配制：取牛血清白蛋白10mg，醋酸钙32mg，加水60mL溶解，加冰醋酸580μL，用2mol/l氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，全量转移至100mL量瓶中，用水稀释至刻度...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玲，段成昆，郑会武，
申请(专利权)人：山东万邦赛诺康生化制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37