一种游离巯基的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种游离巯基的检测方法，该检测方法包括以下步骤：1)反应液制备：先配制浓度为0.1mol/L的硫酸钠溶液，再加入EDTA得到浓度为1mmol/L的EDTA反应液；2)工作液制备：将Ellman试剂溶解于反应液中，配制浓度为10mmol/L的工作液；3)标准品溶液制备；4)取样供试；5)测定计算：将待测样品或标准品在412nm处测定吸光度，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算待测样品浓度。本发明专利技术的检测方法操作简单，成本低廉，样品量低，最多能同时检测91个样品，检测时间大大减少，仅需15min。

【技术实现步骤摘要】
一种游离巯基的检测方法
本专利技术涉及蛋白质巯基检测
，具体涉及一种游离巯基的检测方法。
技术介绍
蛋白质中的自由巯基是生物制药过程中质量监测的一个重要检测项目，目前常见的巯基含量测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)、液相色谱-质谱联用法(HPLC-GC)等。其中，液相色谱法使自由巯基检测灵敏度和准确度有所提高，但是操作相对复杂，对仪器的依赖性高，且耗时较长，不能同时检测多个样品。Ellman试剂为5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，与自由巯基反应后生成2-硝基-5-巯基苯甲酸，在412nm处有强吸收峰，是一种经典的自由巯基定量检测方法，这种方法简单快速，反应条件温和，被中国药典收录为蛋白质自由巯基检测方法。该法可以同时测定总自由巯基，受到广泛使用，但是，该法在操作中具有一定的局限性。首先，传统的紫外分光光度计检测法需要的样品量较多，不适合少量样品的检测；其次，受限于仪器通量，无法同时快速测定多个样品。此外，本专利技术所使用的检测设备为酶标仪。酶标仪实际上就是一台变相光电比色计或分光光度计，其基本工作原理与主要结构和光电比色计基本相同。光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，进入塑料微孔极中的待测标本。该单色光一部分被标本吸收，另一部分则透过标本照射到光电检测器上，光电检测器将待测标本不同而强弱不同的光信号转换成相应的电信号，电信号经前置放大、对数放大、模数转换等信号处理后送入微处理器进行数据处理和计算，最后由显示器和打印机显示结果。但是，在酶标仪的实际使用中发现，存在以下问题：1、测量室的密封性较差，加上缺乏精确的温度控制结构，使得温控不准确，热量容易从盖板与测量室的缝隙处流失，外部的光线如果照射或折射进入光电检测器件上，会严重影响仪器的检测结果；2、现有的酶标孔板上大多设置为96个微孔杯，微孔杯与酶标孔板是一体设置的，如果一次检测没有使用完全，需要对全部的微孔杯进行清洗或整体替换，大大增加了清洗或检测成本。
技术实现思路
为了克服上述的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种游离巯基的检测方法，该检测方法操作简单，成本低廉，样品量低，最多能同时检测91个样品，检测时间大大减少，仅需15min，而以每个样品3min为例，高效液相色谱检测91个样品需要273min；同时检测方法适用的酶标仪，其测量室具有良好的气密性，检测腔室内部温度感应灵敏，微孔杯清洗更换方便，大大节约了检测成本。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：本专利技术提供了一种游离巯基的检测方法，包括以下步骤：1)反应液制备：称取硫酸钠，加水溶解，摇匀后，加入氢氧化钠调节pH至8.0，再加水定容，得到浓度为0.1mol/L的硫酸钠溶液；称取EDTA并添加至至硫酸钠溶液中，混匀，得到浓度为1mmol/L的EDTA反应液；2)工作液制备：按照每0.004gEllman试剂对应1mL反应液，将Ellman试剂溶解于步骤1)制备的反应液中，配制浓度为10mmol/L的工作液；3)标准品溶液制备：按照每13.17mg半胱氨酸盐酸盐对应50mL反应液，将半胱氨酸盐酸盐溶解于反应液中，制得浓度为1.5mM的标准品储备液，使用反应液梯度稀释得标准品溶液；4)取样供试：取待测样品或标准品25μL，加入酶标仪的酶标孔板中，每个孔中加入255μL反应体系，混合均匀后室温孵育15min，其中，反应体系由反应液与工作液按照体积比1:50混合均匀后得到；5)测定计算：将待测样品或标准品在412nm处测定吸光度，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，通过该标准曲线计算待测样品浓度。作为本专利技术进一步的方案，所述酶标仪包括外壳体、测量室、显示器、光电转换机构，外壳体呈长方体状，测量室贯穿外壳体的一侧的顶部，显示器设于外壳体的另一侧顶部，光电转换机构设于外壳体的内部；所述测量室包括：上盖板、检测腔室，上盖板盖合在检测腔室上，上盖板与检测腔室的横截面均呈长方形，上盖板长度方向的两侧外缘底部设有密封片；所述上盖板宽度方向的两侧设有滚动齿轮，两侧对应的滚动齿轮的中轴线处设有滚动轴承；检测腔室内设置有直行齿条、滑轨、温度感应器，直行齿条设于检测腔室宽度方向的两端，直行齿条的路径上间隔设置有齿轮卡合腔，直行齿条与滚动齿轮相啮合；通过直行齿条与滚动齿轮的啮合，上盖板可以沿直行齿条的路径滑动，当上盖板完全盖合在检测腔室上时，滚动齿轮卡合在齿轮卡合腔内；所述滑轨平行设置在检测腔室内，工作台设置在滑轨上，工作台底部的两侧设有与滑轨滑动配合的滑块；滑轨的两侧设有用于限制工作台移动的限位块；温度感应器设置在工作台的两侧；所述工作台上设置有检测孔，检测孔上插接有与其间隙配合的酶标孔板。作为本专利技术进一步的方案，所述酶标孔板包括孔板主体、微孔杯、定位框架，微孔杯呈8×12的矩形阵列分布。作为本专利技术进一步的方案，所述定位框架包括一体成型的微孔环、横向连接件、纵向连接件，微孔环与微孔杯一一对应且与微孔杯间隙配合，横向相邻的微孔环之间连接有横向连接件，纵向相邻的微孔环之间连接有纵向连接件。作为本专利技术进一步的方案，所述横向连接件与纵向连接件结构相同，均包括第一连接件、第二连接件，第一连接件与第二连接件的均呈由外侧向内侧逐渐变窄的内凹状，第一连接件与第二连接件上由外侧至内侧设有若干个贮液孔，贮液孔的数量由外侧到内侧逐渐减少，贮液孔之间分布有导热丝。作为本专利技术进一步的方案，所述密封片的形状为波浪状、圆角梯形状或半椭圆形状，材质为弹性橡胶或聚四氟乙烯薄膜。作为本专利技术进一步的方案，所述光电转换机构包括由上到下依次排列的光源、上透镜、中间透镜、滤光片、下透镜、光电池，光电转换机构的数量为八组，每组光电转换机构的光源、上透镜、中间透镜和下透镜的光学中心排列在一条直线上，每组光电转换机构的滤光片固定在同一个滤光片架上。本专利技术酶标仪的工作方法如下：(1)将待测样品加入微孔杯中，待加入完毕后，将酶标孔板放入工作台上，上盖板通过其上的滚动齿轮沿与之啮合的直行齿条滑动，当滚动齿轮滑动到齿轮卡合腔内时，上盖板与检测腔室紧密盖合，同时密封片对对检测腔室长度方向的外侧进行密封；(2)处理器控制导热丝的加热，迅速对微孔杯进行升温，温度感应器进行温度的感应，并将温度数据发送给处理器，处理器进一步对升温的速率进行调控，当达到设定温度时，处理器控制导热丝停止加热；(3)光源发出光之后，垂直向下经过上透镜，经过聚光，焦点落于微孔杯内部中心位置，之后光束开始发散，穿过微孔杯底部到达中间透镜，之后形成平行光束，照射到滤光片上，得到单一波长的光，然后到达下透镜，再一次聚光，汇聚后被光电池吸收，进而转换为电信号，发送到处理器进行分析处理；(4)当检测完毕后，需要更换整体更换清洗时，直接将酶标孔板取下清洗，清洗液可以进入贮液孔内，贮液孔内的清洗液可以净化后再次使用；若只使用部分微孔杯，只需要对部分微孔杯进行清洗更换时，只需将微孔杯从微孔环上取下即可。本专利技术的有益效果：1、本专利技术的游离巯基检测方法，仅需通过反应液制备、工作液制备、标准品溶液制备、取样供试、测定计算即可得到待测样品的游离巯基浓度，操作简单，成本低廉，样品量低，最多能同时检测91个样品，检测时间大大减少，仅需15min，而以每个样品3mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种游离巯基的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)反应液制备：称取硫酸钠，加水溶解，摇匀后，加入氢氧化钠调节pH至8.0，再加水定容，得到浓度为0.1mol/L的硫酸钠溶液；称取EDTA并添加至至硫酸钠溶液中，混匀，得到浓度为1mmol/L的EDTA反应液；2)工作液制备：按照每0.004g Ellman试剂对应1mL反应液，将Ellman试剂溶解于步骤1)制备的反应液中，配制浓度为10mmol/L的工作液；3)标准品溶液制备：按照每13.17mg半胱氨酸盐酸盐对应50mL反应液，将半胱氨酸盐酸盐溶解于反应液中，制得浓度为1.5mM的标准品储备液，使用反应液梯度稀释得标准品溶液；4)取样供试：取待测样品或标准品25μL，加入酶标仪的酶标孔板中，每个孔中加入255μL反应体系，混合均匀后室温孵育15min，其中，反应体系由反应液与工作液按照体积比1:50混合均匀后得到；5)测定计算：将待测样品或标准品在412nm处测定吸光度，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，通过该标准曲线计算待测样品浓度。

【技术特征摘要】
1.一种游离巯基的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)反应液制备：称取硫酸钠，加水溶解，摇匀后，加入氢氧化钠调节pH至8.0，再加水定容，得到浓度为0.1mol/L的硫酸钠溶液；称取EDTA并添加至至硫酸钠溶液中，混匀，得到浓度为1mmol/L的EDTA反应液；2)工作液制备：按照每0.004gEllman试剂对应1mL反应液，将Ellman试剂溶解于步骤1)制备的反应液中，配制浓度为10mmol/L的工作液；3)标准品溶液制备：按照每13.17mg半胱氨酸盐酸盐对应50mL反应液，将半胱氨酸盐酸盐溶解于反应液中，制得浓度为1.5mM的标准品储备液，使用反应液梯度稀释得标准品溶液；4)取样供试：取待测样品或标准品25μL，加入酶标仪的酶标孔板中，每个孔中加入255μL反应体系，混合均匀后室温孵育15min，其中，反应体系由反应液与工作液按照体积比1:50混合均匀后得到；5)测定计算：将待测样品或标准品在412nm处测定吸光度，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，通过该标准曲线计算待测样品浓度。2.根据权利要求1所述的游离巯基的检测方法，其特征在于，所述酶标仪包括外壳体(1)、测量室(2)、显示器(3)、光电转换机构，外壳体(1)呈长方体状，测量室(2)贯穿外壳体(1)的一侧的顶部，显示器(3)设于外壳体(1)的另一侧顶部，光电转换机构设于外壳体(1)的内部；所述测量室(2)包括：上盖板(21)、检测腔室(22)，上盖板(21)盖合在检测腔室(22)上，上盖板(21)与检测腔室(22)的横截面均呈长方形，上盖板(21)长度方向的两侧外缘底部设有密封片(23)；所述上盖板(21)宽度方向的两侧设有滚动齿轮(24)，两侧对应的滚动齿轮(24)的中轴线处设有滚动轴承(25)；检测腔室(22)内设置有直行齿条(26)、滑轨(27)、温度感应器(28)，直行齿条(26)设于检测腔室(22)宽度方向的两端，直行齿条(26)的路径上间隔设置有齿轮卡合腔(32)，直行齿条(26)与滚动齿轮(24)相啮合；通过直行齿条(26)与滚动齿轮(24)的啮合，上盖板(21)可以沿直行齿条(26...

【专利技术属性】
技术研发人员：林帅，唐慧娴，李浩强，
申请(专利权)人：杭州皓阳生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33