一种甘蔗组培苗种源的低温保存方法以及培育方法技术

本发明专利技术涉及甘蔗种苗保存领域，具体而言，涉及一种甘蔗组培苗种源的低温保存方法以及培育方法。一种甘蔗组培苗种源的低温保存方法，包括以下步骤：丛生芽切割后在海藻酸钠溶液中浸泡，然后将丛生芽块放入氯化钙溶液中，利用海藻酸钠与氯化钙反应生成的凝胶类物质包埋丛生芽块；包埋的丛生芽块进行低温保存即可。本发明专利技术提供的甘蔗组培苗种源的低温保存方法，采用海藻酸钠与氯化钙反应生成的凝胶类物质包埋丛生芽块，然后将包埋的丛生芽块进行低温保存即可，使得丛生芽由原来的继代周期为20‑30天变成低温保存的继代周期3‑4个月，大大延长了继代周期，减少了继代次数，可根据需要进行扩繁。

【技术实现步骤摘要】
一种甘蔗组培苗种源的低温保存方法以及培育方法
本专利技术涉及甘蔗种苗保存领域，具体而言，涉及一种甘蔗组培苗种源的低温保存方法以及培育方法。
技术介绍
甘蔗是我国重要的一种糖料作物，甘蔗糖占我国食糖产量的85％以上，加强甘蔗种质资源的保护与利用对于促进甘蔗品种改良，提高蔗糖产量，保障我国食糖安全具有重要的意义。种质资源的保护与开发利用是培育优良品种的基础，尤其是一些高抗生物胁迫或非生物逆境胁迫的特异抗性种质，在应对未来自然灾害方面具有巨大的应用潜力。但是由于甘蔗植株高大、生育期长等生物学特点，目前以营养体作为保育的技术难以保育大量的种质，许多育种过程中选择的特异材料不得以而丢弃。目前的甘蔗保育技术难以保育大量种质的主要原因在于：(1)甘蔗是由热带种、细茎野生种等物种杂交形成的基因组复合体，甘蔗的种子不是纯合体，而是高度分离，每一粒种子的基因型都不一致，因此甘蔗不能够用种子保育，一般是通过种茎繁殖保育，利用种茎繁育也是国内外甘蔗种质保育的通用办法；(2)甘蔗植株高大，一般可达3米以上，此外甘蔗分蘖力强，一般每丛甘蔗都有5条以上的分蘖，保育单份种质往往需要3.0m2(按照行距1.5米，每个种质种植2米)以上的面积，甘蔗保育用地面积大；(3)甘蔗生育期长，一般为12月左右，田间保育用工成本高；(4)甘蔗一般只能适宜在热带和亚热带生长，而且开花条件极为苛刻，在我国只有在海南三亚适宜开花杂交，因此即使甘蔗种质在其他地区保育，但是因无法获得保育种质的开花特性，难以发掘其利用价值，保育的意义也不大。由于甘蔗种质保育难度较大，我国各甘蔗种质资源库的保育数量一般只有几千份，远远落后于其他作物的上万份甚至几十万份的保育数量。我国一个育种单位每年播种的实生苗在10万株以上，每年选择到的具有不同特点的优异基因型可达几十份甚至上百份。除了极个别的能够大面积的推广的品系外，其他品系往往因为保育能力的不足而不得不淘汰。因此，建立新型的种质保育技术，扩大保育种质的数量，对于促进甘蔗育种改良具有重要的意义。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种甘蔗组培苗种源的低温保存方法，使丛生芽由原来的继代周期为20-30天变成低温保存的继代周期3-4个月。本专利技术的第二目的在于提供一种甘蔗组培苗种源的培育方法，该方法使得低温保存的丛生芽进行恢复。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种甘蔗组培苗种源的低温保存方法，包括以下步骤：丛生芽切割后在海藻酸钠溶液中浸泡，然后将丛生芽块放入氯化钙溶液中，利用海藻酸钠与氯化钙反应生成的凝胶类物质包埋丛生芽块；包埋的丛生芽块进行低温保存即可。本专利技术提供的甘蔗组培苗种源的低温保存方法，采用海藻酸钠与氯化钙反应生成的凝胶类物质包埋丛生芽块，其中，海藻酸钠具有一定的硬度，在氯化钙溶液中可以迅速固化成透明的小胶球，可起到支持和保护作用；然后将包埋的丛生芽块进行低温保存即可，使得丛生芽由原来的继代周期为20-30天变成低温保存的继代周期3-4个月，大大延长了继代周期，减少了继代次数，可根据需要进行扩繁。海藻酸钠溶液的浓度与氯化钙溶液的浓度过高过低均对保存不利，过高，则生成的凝胶类物质阻止细胞呼吸，保存时间反而不能长久；若过低，则形成不了有效的保护层，保存时间也大打折扣。进一步地，所述海藻酸钠溶液的质量浓度为4％±0.5％。进一步地，丛生芽切割后在海藻酸钠溶液中浸泡2～3min。通过适当浓度的海藻酸钠对丛生芽进行浸泡，使得海藻酸钠浸入丛生芽的表面，后续步骤中，将丛生芽放入氯化钙溶液中，海藻酸钠与氯化钙反应，生成的凝胶类物质附着在丛生芽的表面，使得丛生芽包埋，该状态的丛生芽进行低温保存，能保存的更长久。进一步地，所述氯化钙溶液的质量浓度为2.5％±0.5％。适当浓度的氯化钙与海藻酸钠反应，生成适当的凝胶类物质，为丛生芽的保存提高良好的基础。进一步地，凝胶类物质包埋丛生芽块后用无菌水冲洗3～4次，置于无菌纸上吸去表面水分，再进行低温保存。通过冲洗其他未反应的物质，为丛生芽的保存提供良好的基础。进一步地，所述低温保存的培养温度为14～18℃，培养光照为800-1000lx，光照时间10-12小时。进一步地，所述低温保存的培养基以1/2MS为溶剂，含有以下组分：6-苄氨基腺嘌呤0.20～0.80mg/L，多效唑0.02～0.1mg/L，蔗糖10～20g/L，琼脂6～7g/L，pH为5.8～6.2。进一步地，所述丛生芽采用以下方法制备：选取生长健壮、无病害的甘蔗植株，选取幼嫩生长力强的茎芽，切段留存单芽5～7厘米，用水清洗后，于52±2℃水浴2小时，取出后，32±2℃培养10～14天，选取健壮的幼芽，在无菌条件下，将外植体消毒后剥至生长点，进行丛生芽增殖。进一步地，所述丛生芽增殖的培养条件：温度28～31℃，光照强度1800～2100lx，光照时间15-17小时/天。进一步地，接种到腋芽启动培养基中进行丛生芽增殖，所述腋芽启动培养基以MS培养液为溶剂，含有以下组分：6-苄氨基腺嘌呤1.0～2.0mg/L、吲哚丁酸0.2～0.6mg/L、蔗糖20～30g/L、琼脂5.5～7g/L，pH为5.8～6.2。进一步地，所述腋芽启动培养基上进行丛生芽增殖到第2～3代时，每个外植体有3～5个芽，取样3～4个进行“花叶病”的病毒免疫学检测，检测无病菌的株系用于种源低温保存。本专利技术还提供了一种甘蔗组培苗种源的培育方法，上述的低温保存方法得到的甘蔗组培苗种源转接到恢复生长培养基中培养15～20天时，将恢复生长的包埋体接种到新的恢复生长培养基中进行增殖快繁，获得丛生芽。进一步地，所述恢复生长培养基中的培养条件：温度26～31℃，光照强度1800～2100lx，光照时间15-17小时/天。进一步地，所述恢复生长培养基以MS培养液为溶剂，含有以下组分：6-苄氨基腺嘌呤1.0～2.0mg/L、吲哚丁酸0.2～0.6mg/L、蔗糖20～30g/L、琼脂5.5～7g/L，pH为5.8～6.2。进一步地，所述丛生芽经生根培养得到试管苗，所述生根培养步骤为：获得的丛生芽切成带有2～3个芽的丛生芽，转入生根培养基中生根培养，培养温度28～31℃，光照度1800～2100lx，光照时间15-17小时/天，直至长成试管苗。本专利技术提供的甘蔗组培苗种源的培育方法，是对上述保存的组培苗种源进行恢复培养的过程，即在保存过程中，当需要试管苗时，可将低温保存的丛生芽经种源恢复生长、继代增殖又获得丛生芽，丛生芽经的保存时间延长。丛生芽经生根培养后，在短时间内获得大量的试管苗，为甘蔗种苗的适时生产提供一条有效的途径。利用本专利技术提供的方法，每份种质只需要占用0.002m3(按照6个培养瓶，50株苗计算)的体积，且是通过调控培养条件，减缓生长速度，延长培养时间，减少继代次数，显著降低成本。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术采用独特的包埋技术包埋后对丛生芽(种源)进行低温保存处理，延长了丛生芽的继代周期。(2)本专利技术还配合合适的培养温度和培养光照等培养条件对丛生芽(种源)进行低温保存处理，使丛生芽由原来的继代周期为20-30天变成低温保存的继代周期3-4个月。(3)本专利技术通过技术创新，结合甘蔗生物学特点，建立了应用组培苗低温保存甘蔗种质的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甘蔗组培苗种源的低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：丛生芽切割后在海藻酸钠溶液中浸泡，然后将丛生芽块，放入氯化钙溶液中，利用海藻酸钠与氯化钙反应生成的凝胶类物质包埋丛生芽块；包埋的丛生芽块进行低温保存即可。

【技术特征摘要】
1.一种甘蔗组培苗种源的低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：丛生芽切割后在海藻酸钠溶液中浸泡，然后将丛生芽块，放入氯化钙溶液中，利用海藻酸钠与氯化钙反应生成的凝胶类物质包埋丛生芽块；包埋的丛生芽块进行低温保存即可。2.根据权利要求1所述的甘蔗组培苗种源的低温保存方法，其特征在于，所述海藻酸钠溶液的质量浓度为4％±0.5％；进一步地，丛生芽切割后在海藻酸钠溶液中浸泡2～3min。3.根据权利要求2所述的甘蔗组培苗种源的低温保存方法，其特征在于，所述氯化钙溶液的质量浓度为2.5％±0.5％。4.根据权利要求1所述的甘蔗组培苗种源的低温保存方法，其特征在于，凝胶类物质包埋丛生芽块后用无菌水冲洗3～4次，置于无菌纸上吸去表面水分，再进行低温保存。5.根据权利要求1所述的甘蔗组培苗种源的低温保存方法，其特征在于，所述低温保存的培养温度为14～18℃，培养光照为800-1000lx，光照时间10-12小时。6.根据权利要求5所述的甘蔗组培苗种源的低温保存方法，其特征在于，所述低温保存的培养基以1/2MS为溶剂，含有以下组分：6-苄氨基腺嘌呤0.20～0.80mg/L，多效唑0.02～0.1mg/L，蔗糖10～20g/L，琼脂6～7g/L，pH为5.8～6.2。7.根据权利要求1-6任一项所述的甘蔗组培苗种源的低温保存方法，其特征在于，所述丛生芽采用以下方法制备：选取生长健壮、无病害的甘蔗植株，选取幼嫩生长力强的茎芽，切段留存单芽5～7厘米，用水清洗后，于52±2℃水浴2小时，取出后，32±2℃培养10～14天，选取健壮的幼芽，在无菌条件下，将外植体消毒后剥至生长点，进行丛生芽增...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐永文，樊丽娜，何慧怡，劳方业，
申请(专利权)人：广东省生物工程研究所广州甘蔗糖业研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44